体外培养支气管上皮细胞(16HBE),分别用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-8.0μmol/L)、NiS (2.0μmol/L)+扶正解毒(FJD)含药血清(低、中、高剂量组、空白血清组)处理细胞24h,用台盼蓝法检测支气管上皮细胞的存活率。取对数生长期的16HBE细胞接种于24孔培养板内,6×106个／孔,每个剂量设5个复孔,按实验分组分别加入受试物,继续培养24h,各组细胞弃去上清液,每孔加入500μl细胞裂解液,冰上放置30min,将裂解液作用后的各组细胞转移至Eppendorf管,离心20min,取上清液进行谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)活性检测。将受试物处理后的各组细胞以PBS反复洗涤细胞,直至显微镜下大部分细胞已超声破碎,进行超氧化歧化酶(SOD)活性的检测。用考马斯亮兰蛋白测定法,用分光光度计测定波长595nm处吸光度OD值,计算蛋白含量,结合蛋白浓度计算16HBE细胞(细胞处理方法同前)内丙二醛(MDA)含量。2.将16HBE细胞接种于25ml培养瓶中,每孔接种的细胞数为6×106,培养24h后,用NiS

(1-5.0μmol/L)染毒,并用无菌的MEM、NiS (2.0μmol/L)+不同剂量FJD含药血清、空白血清、以及三种抑制剂,磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化氨基未端蛋白激酶(P-JNK)处理细胞24h,无菌PBS洗涤细胞2次,胰酶消化后制成细胞悬液,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹杂交(Western 很少 blot)法观察各组细胞中磷酸化ERK、P38和JNK的表达。3.将16HBE细胞用无菌的MEM、不同浓度的NiS (1.0-4.0μmol/L)、NiS (2.0μmol/L)+FJD含药血清(低、中、高剂量组)处理细胞24h后,用免疫组化法检测各组细胞中核转录因子(NF-κB)κB的活性,并进行半定量分析,用RT-PCR法测定支气管上皮细胞中NF-κB P65的表达。本次实验采用SPSS13.0统计软件进行相关分析,多组间比较采用方差分析,两组之间的比较采用T检验,P0.05)。NiS能明显激活细胞P-JNK的表达(P0.05),阴性对照组细胞中P-ERK1表达值为0.210,NiS浓度分别为1、2、4.0μmol/L,染镍组细胞中P-ERK1表达值分别为0.216、0.219、0.226,FJD低、中、高剂量含药血清组和P-ERK1抑制剂对磷酸化P-ERK1的表达无明显影响(P>0.05)。4.NiS能明显激活NF-κB和NF-κB

那个 P65的表达(P
第一部分 P38 MAPK在变应性鼻炎大鼠鼻腔粘膜中的表达 目的：探讨p38 MAPK蛋白及mRNA在变应性鼻炎大鼠和正常对照大鼠鼻腔粘膜中的表达情况。 方法：建立SD大鼠变应性鼻炎动物模型,采用免疫组织化学染色法检测p38MAPK蛋白在变应性鼻炎组大鼠和正常对照组大鼠鼻腔黏膜中的表达差异,采用实时荧光定量RT-PCR检测两组大鼠鼻腔黏膜p38 点击此处 MAPK mRNA表达水平。 结果：免疫组化染色结果显示p38 MAPK在变应性鼻炎组大鼠鼻腔黏膜中的表达较正常对照组大鼠明显增高(P＜0.05)。实时定量RT-PCR检测结果显示p38 MAPK mRNA在变应性鼻炎组大鼠鼻腔黏膜中表达较正常对照组明显增高(P＜0.05)。 结论：p38 MAPK在变应性鼻炎大鼠鼻腔黏膜中表达水平增高,提示p38 MAPK可能参与了变应性鼻炎的发病过程。 第二部分 P38 MAPK在变应性鼻炎大鼠PBMCs中的表达及对Th2类细胞因子的调控作用 目的：探讨变应性鼻炎大鼠外周血单个核细胞(PBMCs)中p38 MAPK蛋白及mRNA的表达情况,同时探讨p38 MAPK特异性抑制剂SB 239063对外周血单个核细胞Th2类细胞因子IL-4,IL-5表达的影响。 方法：建立变应性鼻炎大鼠模型,通过心脏穿刺获取外周血,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs,实时荧光定量RT-PCR检测大鼠外周血单个核细胞p38MAPK

mRNA的表达。Western blot检测外周血单个核细胞p38 MAPK蛋白的表达水平及活性情况。PBMCs在不同浓度p38 MAPK特异性抑制剂SB 239063作用下培养后,ELISA检测细胞上清液中IL-4, IL-5蛋白表达水平。 结果：结果显示变应性鼻炎组大鼠p38 MAPK mRNA的表达量及蛋白总表达量明显高于对照组(P＜0.05),AR组大鼠磷酸化p38 MAPK(代表p38 MAPK的活性)表达量较对照组升高,磷酸化p38 MAPK与总p38 MAPK的比值也较对照组明显增高(P
目的1.研究正常妊娠、子痫前期胎盘组织中神经激肽B(neurokinin B, NKB)及其受体(neurokinin B receptor, NKR)在蛋白和mRNA水平的表达,以及正常妊娠、子痫前期孕妇血浆中神经激肽B的含量,籍此探讨神经激肽B和子痫前期的关系； 2.研究活化状态的p38MAPK蛋白在正常与子痫前期胎盘中的表达,探讨NKB与p-p38MAPK表达的相关性。 方法选择正常妊娠、轻度子痫前期、重度子痫前期患者各20例,采用酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测孕妇血浆中NKB含量；采用伊红—苏木素(HE)染色,光镜观察正常妊娠和子痫前期胎盘结构的病理学改变；用免疫组织化学检测胎盘组织中NKB/NKR、p38MAPK蛋白的定位及定量表达；用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerasechain reaction, RT-PCR)检测胎盘组织中NKB/NKR mRNA的表达。 结果1.轻度及重度子痫前期孕妇血浆中NKB水平明显高于正常孕妇； 2.

274,0.920和0.144,p值分别为0.619,0.337和0.704, p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1的表达与无病生存率之间无明显统计学差异。结论：mTOR信号通路及其下游分子4EBP1和S6K1在浸润性乳腺癌组织中被显著激活。磷酸化4EBP1和S6K1在细胞浆中表达增高可能与乳腺癌的发生相关。p-4EBP1的表达可能是维、汉民族之间差异的原因之一；4EBP1和S6K1的表达不能作为乳腺癌预后的独立指标。 第二部分：mTOR信号通路及其下游分子4EBP1和S6K1蛋白表达在转录水平的调控研究 目的：探讨mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1蛋白在新疆维汉乳腺浸润性乳腺癌组织中的表达情况,以及是否受其相应mRNA表达的调控。方法：随机选取285例于2005年3月-2009年9月期间就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的维吾尔族、汉族女性浸润性乳腺癌患者癌组织与癌旁组织病理切片,使用免疫组化方法染色,通过染色结果评价磷酸化mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的表达情况。选取46对维、汉新鲜乳腺癌组织和癌旁组织样本,使用Western-blot蛋白检测方法检测mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的表达情况。随机收集2012年1月至2012年6月期间126例就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的新鲜乳腺癌及癌旁组织标本,使用荧光定量rtPCR方法检测mTOR、4EBP1和S6K1在癌组织和癌旁组织中的mRNA水平并进行对照研究。结果：新疆维、汉族浸润性乳腺癌组织和癌旁组织病理切片中p-mTOR的表达阳性率分别是72%(206/285)和60%(170/285),p=0.001;

更多 p-4EBP1的表达阳性率分别是26%(74/285)和8%(24/285),p=0.000；p-S6K1的表达阳性率分别是42%(120/285)和18%(50/285),p=0.000,P值均小于0.01,差别均有显著统计学差异,p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1的在癌组织中的表达均明显高于癌旁组织。Western-blot结果提示p-mTOR在癌组织中表达的灰度平均值是1.490,癌旁组织是0,p=0.001;p-4EBP1在癌组织中表达的灰度平均值是1.759,癌旁组织是1.676,p=0.725;p-S6K1在癌组织中表达的灰度平均值是4.407,癌旁组织是3.657,p=0.473,三者在癌组织中的表达均高于癌旁组织。mTORmRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中表达的平均水平分别是14.83、19.78, 和 MLN2238 t=-1.376, p=0.174; S6K1mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中表达的平均水平分别是66.06,87.51, t=-1.15, p=0.254;4EBP1mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中表达的平均水平分别是12.70、10.33,t=0.379,p=0.706,三者差异均无明显统计学意义(p>0.05)。结论:mTOR信号通路及其下游分子4EBP1和S6K1在浸润性乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,该信号通路在浸润性乳腺癌组织中被显著激活。mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1mRNA在癌组织中的表达未见明显增高,其相应蛋白质表达的调控位点可能位于转录后水平或蛋白质水平。

第三部分：mTOR信号及其下游分子4EBP1和S6K1在新疆维、汉不同民族浸润性乳腺癌中表达的差异研究目的：探讨mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1在新疆维吾尔族和汉族浸润性乳腺癌组织中的表达差异情况。方法：随机选取285例于2005年3月1日-2009年9月30日就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院的维吾尔族、汉族女性浸润性乳腺癌患者癌组织病理资料,使用免疫组化方法检测磷酸化的mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的表达状况；选取63例维、汉新鲜乳腺癌组织样本,使用荧光定量rtPCR方法进一步检测mTOR及其下游分子4EBP1和S6K1的mRNA表达状况。结果：免疫组化染色结果显示,在维吾尔族和汉族乳腺癌组织中,p-mTOR的表达阳性率分别是54%和46%(p=0.067), p-4EBP1的表达阳性率分别是62%和38%(p=0.020),p-S6K1的表达阳性率分别是49%和51%(p=0.695)。荧光定量rtPCR结果显示,维、汉乳腺癌组织中mTORmRNA2－ΔΔct平均值分别为10.88和19.7,差异有统计学意义(p=0.045),4EBP1mRNA2－ΔΔct平均值分别为52.72和80.74,差异无统计学意义(p=0.128),S6K1mRNA2－ΔΔct平均值分别为7.97和17.92,差异无统计学意义(p=0.404)。结论：在mTOR信号通路中,p-mTOR和p-S6K1蛋白的表达无明显维、汉民族差异,而p-4EBP1在维吾尔族中的表达显著升高,且存在统计学差异,可能成为研究维、汉不同民族之间乳腺癌差异及个体化治疗的新方向。维、汉之间mTORmRNA表达水平存在差异,但因P值接近0.

01),血尿素氮显著升高(P<0.01),且运动组大鼠睾酮、睾酮皮质酮比值、血红蛋白较正常组分别下降71.81%、85.21%和23.12%,皮质酮较正常组升高94.79%,分别超过30%、30%、20%和20%的人类过度训练诊断参考标准。同时,骨骼肌MDA含量明显升高(P<0.01),SOD活性和总抗氧化能力明显下降(P<0.05)。肌糖原含量没有显著的变化,血糖出现了显著下降,p38的蛋白表达出现显著的升高(P<0.01)。结论:过度训练引起的肌能量大量消耗,自由基生成加强,抗氧化能力减弱,过剩的自由基通过p38激活了MAPK系统,但这种激活并没有增加肌糖原的含量,推测MAPK对骨骼肌代谢的调节作用可能被低血糖水平所抑制。
目的:构建人FGFR2IIIc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2IIIc的重组细胞株,初步研究FGFR2IIIc对L6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得FGFR2IIIc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2IIIc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2IIIc。将该重组表达载体和Viral

{TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂| 购买TNF-alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂半抑制浓度|TNF-alpha抑制剂 价格|TNF-alpha抑制剂 花费|TNF-alpha抑制剂溶解度|TNF-alpha抑制剂购买|TNF-alpha抑制剂制造商|TNF-alpha抑制剂研究购买|TNF-alpha抑制剂订单|TNF-alpha抑制剂小白鼠|TNF-alpha抑制剂化学结构|TNF-alpha抑制剂分子量|TNF-alpha抑制剂分子重量|TNF-alpha抑制剂数据表|TNF-alpha抑制剂供应商|TNF-alpha抑制剂体外|TNF-alpha抑制剂细胞系|TNF-alpha抑制剂浓度|TNF-alpha抑制剂核磁共振|TNF-alpha抑制剂体内|TNF-alpha抑制剂临床试验|TNF-alpha抑制剂s|TNF-alpha signaling抑制剂|TNF-alpha pathway抑制剂|TNF-alpha signaling pathway抑制剂|TNF-alpha signaling抑制剂s|TNF alpha pathway抑制剂s|TNF-alpha signaling pathway抑制剂s|TNF-alpha抑制剂 library|TNF-alpha activity inhibition|TNF-alpha activity|TNF-alpha inhibition|TNF-alpha抑制剂s library|TNF alpha抑制剂 libraries|TNF-alpha抑制剂 screening library|TNF-alpha high throughput screening|TNF-alpha抑制剂s high throughput screening|TNF-alpha phosphorylation|TNF-alpha screening|TNF-alpha assay|TNF-alpha animal study| Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2～4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株。RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2IIIc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系。结果:构建了含人FGFR2IIIc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2IIIc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化。结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2IIIc的重组L6细胞株,FGFR2IIIc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2IIIc基因与成肌分化功能相关性奠定基础。
本研究旨在探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对树突状细胞(DC)发育的影响。首先,利用酶消化法从人脐带分离获得HUVEC,从细胞形态、表型和功能进行鉴定;进一步将获得的HUVEC结合细胞因子配伍与CD14+单核细胞共培养,检测HUVEC对CD14+细胞向DC分化的影响;流式细胞术检测分化细胞的表型,混合淋巴细胞反应检测分化细胞的免疫学功能;采用中和抗体实验和Western

和 selleck化学 blot检测对细胞增殖和分化起重要调控作用的IL-6和VEGF以及ERK和p38MAPK通路的改变。结果表明,从脐静脉分离获得的细胞呈长梭形形态,细胞表型为vWF+CD31+CD73+CD45-HLA-DR-CD86-CD34low,Dil-Ac-LDL吸收实验为阳性,且细胞可诱导形成血管样结构,提示分离获得了HUVEC;进一步将HUVEC与CD14+单核细胞共培养,流式细胞仪检测结果表明HUVEC可抑制CD14+单核细胞向DC的分化,诱导获得的细胞CD1a表达显著降低,混合淋巴细胞检测结果显示,与HUVEC共培养获得的DC刺激T细胞增殖作用显著降低,且具有剂量依赖性;中和抗体实验分析其可能的作用机制表明,IL-6和VEGF在CD14+单核细胞向DC分化过程中具有重要调控作用,Western

blot检测结果说明其主要通过ERK和p38通路完成调控作用。结论:人内皮细胞参与DC的发育,且起到抑制作用。
Mitogen-activated protein kinases(MAPKs)are a family of proteins that constitute signaling pathways involved in processes that control gene expression,cell division, cell survival,apoptosis,metabolism,differentiation and motility.The MAPK pathways can be divided into conventional and atypical MAPK pathways.The first group converts a signal into a cellular response through a relay of three consecutive phosphorylation events exerted by MAPK kinase kinases,MAPK kinase,and MAPK.Atypical MAPK pathways are not organized into this three-tiered cascade.

用转录抑制剂放线菌素d预处理人血管内皮细胞,再以尿酸进行干预,应用real-timepcr在不同时间点检测enosmrna表达水平,以判断尿酸对rna稳定性的影响。3.用enos特异性抑制剂l-name预处理人血管内皮细胞,再用尿酸进行干预,mtt方法检测内皮细胞增殖情况,以判断尿酸对内皮细胞增殖的影响是否直接与enos有关。4.用westernblot方法分别检测不同时间点(10min,20min,30min,40min)经尿酸作用的人血管内皮细胞mapks(p38mapk,jnkmapk,erkmapk)通道是否有激活,判断不同血管内皮细胞是否被激活的mapks通道种类及激活时间不同。5.应用p38mapk通道特异性药物抑制剂(sb203580)预处理人冠状动脉血管内皮细胞,然后加入尿酸,通过real-timepcr的方法检测enosmrna表达水平变化,判断尿酸对enosmrna表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。应用腺病毒负性突变体p38-dn-adv转染人冠状动脉血管内皮细胞后再加入尿酸,通过westernblot方法检测enos蛋白表达水平的变化,判断尿酸对enos蛋白表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。6.pgl2-enos(-331/+109)-fireflyluciferasereporter质粒和pgl2-β-actin-renillaluciferase共转染hcaec细胞后,加入600umol/l尿酸继续培养,双荧光报告基因系统检测尿酸是否影响enos启动子的活性,判断尿酸是否在转录前水平调节enos基因表达。7.用染色质免疫共沉淀技术检测转录因子gata-4与enos启动子的结合情况,以判断尿酸是否对该结合状况有影响。8.通过大鼠腹腔动脉血管环实验检测尿酸对动脉血管舒张功能的影响,并进行统计学分析。三、cyp11b2-344t>c基因多态性与高血压病心房颤动发生的相关性1.通过病例-对照研究进行meta分析,探讨cyp11b2-344t>c基因多态性和心房颤动易感性的关系。2.应用统计软件计算等位基因模型,纯合子模型,隐性模型和显性模型的优势比(or)和95%可信区间(ci),并通过固定效应和随机效应模型评估二者的关联性。3.根据异质性来源的不同进行亚组分析,最后达到应用单一原因对于总体结果进行评价,并对文章的发表偏倚进行评估。研究结果:1.研究发现高血压病患者血尿酸水平升高与心房颤动的发生密切相关(1)本研究共纳入940例患者,其中高血压病合并心房颤动患者362例,高血压病不合并心房颤动患者578例(对照组)。两组患者的性别、白细胞值、血钾值、肌酐值、收缩压、舒张压、左心室后壁厚度及室间隔厚度与心房颤动发生的风险均无统计学差异(p>0.05)。与对照组比较,高血压病合并心房颤动组平均年龄更大(67.13±10.59vs.56.78±14.92,p<0.01)、患高血压病平均时间更长(9.27±9.50vs.3.85±3.57,p<0.01),且血尿酸水平及左心房直径明显高于对照组,分别为388.11±112.51vs.311.54±122.51(p<0.01)及45.79±7.56vs.34.08±4.36(p0.05)和52.88%(p<0.01)。(8)染色质免疫共沉淀技术检测与对照组相比,尿酸使转录因子gata-4与hcaec细胞启动子的结合力增强。(9)在内皮依赖型缓激肽作用下,对照组大鼠离体腹腔主动脉血管环发生舒张。作为阴性对照组的l-name组动脉血管环舒张幅度明显减弱,和对照组相比,尿酸组动脉血管环的舒张幅度减弱48.53%(pc多态性明显与心房颤动易感性显著相关(等位基因模型:or=1.18,95%ci=1.04-1.33,pC基因多态性与心房颤动易感性存在显著的相关性。丰富了对心房颤动发病因素的认识,4.通过心房颤动病因方面的认识,可以从控制体内尿酸值的角度预防高血压病患者心房颤动的发生,为临床防治高血压病心房颤动的发生提供了新的思路。
在哺乳动物免疫系统中,白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)被认为是具有多重功能的重要细胞因子。IL-10由多种细胞分泌并作用于各种免疫细胞,如T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞,调控这些细胞的生长、成熟、增殖、分化与活化,进而影响机体的天然免疫和获得性免疫,并与其它细胞因子一起维持了免疫系统的稳定。硬骨鱼IL-10在多种鱼类包括斑马鱼、金鱼、鲤鱼和虹鳟中被克隆鉴定,但有关硬骨鱼IL-10的免疫调节功能知之甚少,其受体和细胞信号传导途径,以及作用机制均有待阐明。本论文研究草鱼IL-10的免疫学功能,不仅揭示其保守的抑炎症功能,而且阐明它和另一经典抑炎症细胞因子TGF-β1参与免疫反应调节的相互关系和作用机制,从而拓展了对鱼类IL-10免疫学地位的认识。另外,为了解草鱼IL-10发挥作用的分子机制,进一步鉴定了草鱼IL-10介导的IL-10受体1(IL-10R1)和IL-10受体2(IL-10R2)及其下游信号通路(STAT3)和靶基因细胞因子信号转导负调控蛋白3(Suppressor

BIBF 1120数据表 和 HDAC抑制剂 of cytokine signaling 3,SOCS3)。为获悉草鱼IL-10的产生机制,初步探讨了LPS和IFN-γ对草鱼IL-10的转录调控机制。具体研究内容如下:1.

给予GSK3β的特异性阻断剂SB216763（2*10-5M）与RSG（10-6M）共同处理成骨细胞。SB216763能完全逆转RSG对成骨细胞增殖的抑制效应。提示，RSG抑制成骨细胞的增殖也是通过激活GSK3β实现的。 3.进一步探讨RSG抑制增殖作用的受体机制，联合使用PPARγ特异性阻断剂GW9662（10-6M）与RSG（10-6M），结果GW9662不能阻断RSG抑制成骨细胞增殖的作用。进一步利用siRNA干扰技术，敲低细胞内的PPARγ，RSG抑制增殖的效应仍然存在，提示RSG抑制成骨细胞增殖的作用不依赖于PPARγ。

4.为明确RSG是否通过GPR40来抑制成骨细胞的增殖，我们利用siRNA技术，敲低细胞内GPR40，再用RSG处理细胞，结果发现，RSG抑制成骨细胞增值的作用被完全逆转了。这提示，RSG是通过GPR40发挥抑制成骨细胞增殖的效应。 5.我们也观察了SHP-1在成骨细胞增殖中的作用。利用siRNA技术敲低细胞内的SHP-1，成骨细胞的增殖显著降低。提示SHP-1对成骨细胞的增殖具有正向调节作用。 二、异黄酮类植物雌激素对ERE和CRE转录活性的调节 （一）异黄酮类植物雌激素对ERE转录活性的调节 1、利用脂质体瞬时转染的方法，在MG63细胞上分别过表达ERα和ERβ，给与不同浓度的雌激素和植物雌激素（大豆甙元、染料木素、葛根素、山萘酚、槲皮素）处理，结果发现，在过表达ERα时，E2在10-10～10-8M，都能显著促进ERE报告基因的转录；大豆甙元和染料木素在高浓度（10-6M，10-7M）对ERE报告基因的转录有较强的促进作用；其他植物雌激素，除山萘酚在高浓度时（10-6M）有微弱的促进作用外，对报告基因的转录均没有调节作用。 Saracatinib化学结构 过表达ERβ后，除山萘酚和槲皮素的作用与过表达ERα的结果相同外，雌激素和其余的植物雌激素均对报告基因的转录有调节作用。E2从10-9～10-6M，都能显著促进ERE报告基因的转录；大豆甙元以及染料木素对ERE报告基因的转录促进作用均较过表达ERα时的效应显著。而葛根素（10-10～10-6M）对报告基因的转录呈现出非浓度依赖的抑制作用。 2、进一步观察雌激素受体完全拮抗剂ICI182,780以及选择性雌激素受体拮抗剂4-OH-tamoxifen通过不同的ER亚型对ERE报告基因的转录调节作用。将ERα或ERβ与ERE报告基因共转染后，给与ICI182，780或4-OH-tamoxifen处理。ICI182,780仅在过表达ERβ时，对报告基因表现出剂量依赖性的转录抑制效应；4-OH-tamoxifen通过不同的ER亚型，对报告基因的转录调节作用也不同：过表达ERα时，呈现出剂量依赖性的转录促进作用；而过表达ERβ时，则表现出非剂量依赖性的转录抑制效应。

3、将雌激素或植物雌激素与雌激素受体拮抗剂联合使用，观察在过表达不同的雌激素受体亚型后，雌激素或植物雌激素对报告基因的调节作用是否发生改变。结果发现，当过表达ERα时，给与ICI182,780或4-OH-Tam联合作用，雌激素的转录调节作用几乎被完全阻断，大豆甙元和染料木素对报告基因的转录调节作用被部分阻断，而山萘酚的转录调节作用则不受影响。 过表达ERβ时，雌激素，大豆甙元，染料木素以及山萘酚对报告基因的转录调节作用几乎被完全阻断，葛根素对报告基因的转录调节作用则不受影响。由于葛根素表现出拟ERβ拮抗剂样作用，所以当葛根素与雌激素或其他植物雌激素联合使用时，雌激素，大豆甙元，染料木素和山萘酚对报告基因的转录调节作用都能被部分阻断。 （二）异黄酮类植物雌激素对CRE转录活性的调节 1.由于雌激素还具有ERE非依赖的作用机制，我们前期的实验也证明，雌激素对CRE基因具有转录抑制作用。为明确大豆异黄酮是否也具有这样的作用，我们将CRE报告基因转染入MG63细胞中，分别给与不同浓度的雌激素，染料木素和大豆甙元处理。雌激素对CRE报告基因的转录有抑制作用，且具有剂量依赖性。染料木素和大豆甙元都在高浓度时（10-6M），对CRE报告基因具有转录抑制作用。但均不能促进CREB的磷酸化。 Selleck Pazopanib 外源性给予CRE的激动剂8-Br-cAMP，能促进CRE报告基因的转录活性，而雌激素和染料木素能去除8-Br-cAMP对报告基因的促转录效应，大豆甙元则没有此作用。 2.为进一步确定大豆甙元和染料木素在MG63细胞上，对CRE的转录调节作用是否和雌激素的作用相似，我们观察了他们对MG63细胞上的SGK1和IL-8的mRNA表达的影响。这两个基因的启动子区域都含有CRE-like的序列。结果发现，雌激素，染料木素对SGK1和IL8mRNA的表达都有抑制作用，而大豆甙元仅对IL8的mRNA表达有抑制作用。 进一步用8-Br-cAMP诱导，使SGK1和IL8的mRNA的表达增加，再给予雌激素、染料木素和大豆甙元作用，结果也与未使用8-Br-cAMP诱导时的相一致。以上结果都提示大豆甙元和染料木素都具有雌激素样作用，即可以通过调节启动子中含有CRE like的靶基因的转录活性，发挥调节基因转录的效应。并且染料木素和大豆甙元对于不同的基因，调节转录的机制可能也有所不同。

3.为确定ERs的两类亚型在大豆异黄酮物质的上述转录调节作用中分别起何作用。我们将ERα和β分别与CRE报告基因共转染后，给予雌激素和大豆异黄酮作用，观察药物对报告基因转录活性的影响。 将ERα和CRE报告基因共转染后，雌激素和两种大豆异黄酮物质都能剂量依赖性的抑制CRE报告基因的转录活性。再分别给予雌激素受体拮抗剂ICI182780和选择性雌激素受体调节剂4-OH-tamoxifen,以及ERα特异性受体拮抗剂MPP作用。ICI182780和MPP本身通过ERα都能够促进CRE报告基因的转录活性，4-OH-tamoxifen通过ERα则没有转录调节作用；但是，三种药物分别与雌激素和大豆异黄酮共同作用时，都能够逆转雌激素和大豆异黄酮对CRE报告基因的转录抑制作用。 查找更多 将ERβ和CRE报告基因共转染后，雌激素对报告基因的转录抑制作用消失了，大豆甙元和染料木素仍然能够抑制CRE报告基因的转录活性，但是缺乏剂量依赖性。使用ICI182780，4-OH-tamoxifen,以及ERβ特异性受体拮抗剂THC作用后，三种药物通过ERβ对CRE报告基因的转录活性都没有影响；但与大豆甙元和染料木素联合使用后，都能够逆转大豆甙元和染料木素通过ERβ对报告基因的转录抑制作用。 结论： 1. RSG显著抑制颅骨来源的成骨细胞的分化，SHP-1对成骨细胞的分化具有促进作用。两者的作用都是通过改变GSK3β的活性实现的。RSG通过激活GSK3β，促进其磷酸化，进而抑制β-catenin的表达；SHP-1则通过抑制GSK3β的活化，来促进分化。RSG抑制成骨细胞中SHP-1的mRNA表达。RSG抑制成骨细胞分化的作用仅部分依赖于PPARγ；同时，GPR40在诱导成骨细胞分化过程中维持低表达，RSG可促进GPR40表达，后者由此介导了部分RSG作用。 2.

05);经H_2O_2或SPER/NO或HU处理后的SMMC-7721和HepG2细胞较未经处理的SMMC-7721和HepG2细胞增殖明显加快(p0.05)。

结论:1.在正常条件下,人正常肝细胞株中不表达miR-155,而人肝癌细胞株中有少量表达。2.在慢性炎症应激因素作用下人正常肝细胞株中miR-155有微量表达。3.在慢性炎症应激因素作用下肝癌细胞株中miR-155表达量升高、肝癌细胞增殖加快及细胞周期发生改变。4.三种慢性炎症应激因素作用下的两种肝癌细胞株,上述变化无明显区别。
目的研究p38MAPK抑制剂CBS3830在糖尿病大鼠自体移植静脉中抗内膜增生的作用,从而探讨p38MAPK信号通路在静脉桥狭窄中的作用,为糖尿病患者桥血管再狭窄的预防及治疗提供新的途径。 方法将30只SPF级SD雄性大鼠(6～8周龄,体重200～250g,),随机分为假手术组(sham 点击此处 group, S)、对照组(control group,C )、药物组(drug group,D),每组10只。假手术组仅模拟手术过程,不进行血管移植和药物干预;另外两组首先采用腹腔注射链脲佐菌素法建立糖尿病动物模型,然后再采用改良cuff法建立自体静脉移植模型,造模前1 h药物组经胃管灌入0.3 mg/ml的CBS3830 10ml/kg,对照组同法给予等体积的CBS3830溶媒1%甲基纤维素。分别于术前及术后1、3、7 d,采用ELSIA法检测大鼠血清中的TNF-α、IL-1β和AGEs;免疫组织化学染色检测各组大鼠血管标本中核转录因子kappa B(NF-κB)的表达;于第7天处死动物并获取移植静脉标本,HE染色法观察大鼠移植静脉内膜病理变化。蛋白印迹技术(western blotting)测定p38、P-p38、β-actin的表达。 结果药物组TNF-α在0-3d呈上升趋势,第3d时水平达到最高,与对照组相比无明显差别,此后表达水平逐渐下降,至第7d时降到最低,明显低于对照组,有显著性差异(p<0.05)。药物组IL-1β水平在1d时最高,此后表达水平逐渐下降,至第7d时明显低于对照组(p<0.01)。药物组、对照组的AGEs含量均较假手术组明显增加,两组间无明显差异。HE示药物组内膜增生明显低于对照组,差异具有统计学意义(p
目的:动脉粥样硬化(AS)是威胁人类健康的主要疾病之一,对于AS发病机制一直是心血管疾病研究的热点。其中血管平滑肌细胞(VSMC)由中膜层向内膜下间隙迁移并导致异常增生是动脉粥样硬化等心血管疾病发生发展的一个重要环节。PDGF作为一种强有力的体外趋化剂,可以诱导VSMC增殖和迁移。ROCK是Rho下游靶效应分子,分ROCKⅠ和ROCKⅡ两种亚型,参与细胞迁移、细胞增殖、细胞粘附、细胞骨架重组等多种细胞行为,而这些功能又参与许多心血管疾病的发生、发展,而ROCK参与细胞迁移的分子机制尚不十分清楚。有文献报道,MAPK家族成员参与细胞的增殖和迁移,如p38

时间 MAPK,ERK(胞外信号调节激酶)。此外在细胞迁移过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)可以广泛降解ECM,为VSMC的迁移扫清道路,促进VSMC的迁移。本实验研究目的在于通过PDGF介导血管平滑肌细胞迁移的模型,阐述ROCKⅠ亚型调控血管平滑肌细胞研究的分子机制,为阐明动脉粥样硬化发生机理提供理论依据。 方法:(1)利用瞬时转染和稳定转染方法过表达ROCKⅠ,通过RNA和蛋白水平检测ROCKⅠ的表达情况;(2)利用Boyden chamber和划痕方法,检测ROCKⅠ过表达后,细胞的迁移情况;(3)利用Western blot方法,在10ng/ml PDGF刺激下,检测p-ERK和p-p38在不同时间的表达情况;(4)利用Western blot方法,在不同浓度U0126(ERK抑制剂)和SB203580(p38抑制剂)处理下,检测p-ERK和p-p38表达情况;(5)利用Boyden chamber法,在不同浓度U0126和SB203580处理下,检测对细胞迁移的影响;(6)利用Western blot和明胶酶谱法,检测U0126和SB203580对MMP2蛋白表达和活性的影响;(7)利用免疫荧光方法,在不同浓度U0126和SB203580处理下,检测抑制剂对细胞伪足形成的影响。 Selleck Doxorubicin 结果:(1)瞬时转染ROCKⅠ过表达后,细胞迁移明显增加;(2) PDGF (10ng/ml)刺激下,p-ERK和p-p38表达水平分别出现峰值;(3)不同浓度U0126和SB203580处理下,p-ERK和p-p38表达随浓度依赖性下降;(4)在不同浓度U0126和SB203580处理下,细胞迁移能力随浓度依赖性下降;(5)U0126和SB203580均降低MMP2的蛋白表达和活性;

(6)U0126和SB203580减少细胞伪足的形成。 结论:(1)进一步证实ROCKⅠ与血管平滑机细胞的迁移密切相关; (2) PDGF介导的细胞迁移,可能是通过Rho/ROCK/MAPK通路实现的,并通过降解细胞外基质,为细胞迁移提供条件。
目的探讨胡黄连苷Ⅱ在大鼠脑缺血再灌注损伤中的抗氧化作用,为胡黄连苷Ⅱ在脑缺血损伤的临床应用提供理论依据。方法成年健康Wistar大鼠100只.应用线栓法建立MCAO/R模型,随机分为假手术组,阴性对照组,阳性对照组,药物治疗组。假手术组不做处理,阴性对照组经尾静脉注射生理盐水,阳性对照组注射丹参素钠10mg/kg,药物治疗组注射胡黄连苷Ⅱ10mg/kg。Bederson法进行神经功能评分,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定脑梗塞体积,免疫组化检测神经细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑组织匀浆中iNOS和SOD的含量,TUNEL法检测细胞凋亡。结果假手术组神经行为功能正常,无脑梗死。假手术组免疫组化示大鼠脑组织iNOS和SOD弱表达,TUNEL阳性细胞数量较少,散在分布。阴性对照组神经行为功能评分、脑梗死体积较假手术组有明显差异(P<0.05),免疫组化示大鼠脑组织iNOS表达增强,SOD表达明显减弱,脑组织匀浆iNOS增高,SOD降低,TUNEL阳性细胞数量增多,较假手术组有明显差异(P<0.05)。阳性对照组和胡黄连苷Ⅱ组神经行为功能、脑梗死体积低于阴性对照组(P<0.05)。阳性对照组和胡黄连苷Ⅱ组免疫组化示大鼠脑组织iNOS表达及脑组织匀浆iNOS和TUNEL阳性细胞数量均低于阴性对照组(P<0.05),而大鼠脑组织SOD表达及脑组织匀浆SOD均高于阴性对照组(P0.

05%透明质酸酶和0.2%Ⅱ型胶原酶)获得分散的大鼠肋生长板软骨细胞(rat costochondral growth plate chondrocyte,RGC),常规接种,单层培养。对原代～第5代RGC进行生长动力学分析,并通过免疫细胞化学、阿尔新兰染色和Western blot检测原代～第5代RGC中Ⅱ型胶原、α-SMA和蛋白多糖的分布和表达。 结果:原代培养的生长板软骨细胞中95%以上的细胞Ⅱ型胶原阳性染色,细胞核周围和细胞膜周边都有Ⅱ型胶原的阳性染色,阳性染色的纤维包裹着细胞核,保持圆形的细胞强阳性染色。随着传代次数的增加,表达Ⅱ型胶原的细胞比例和表达量下降,第6代RGC中仅保持圆形的细胞仍呈阳性染色。原代培养的RGC表达大量的蛋白多糖,阿尔新兰阳性染色。第2,3代阿尔新兰染色减少,3代后阿尔新兰染色皆呈阴性。原代RGC中,α-SMA的表达很弱,随传代次数增加,α-SMA的表达量逐渐增高;Ⅱ型胶原的表达刚好和α-SMA相反,原代RGC表达最强,随着传代次数的增加,表达逐渐下降。

可能 结论:成功建立大鼠肋生长板软骨细胞的体外培养模型。单层培养的RGC在第4代后逐渐失去分化表型,α-SMA可以作为RGC去分化的一个新的标志物。
血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)是机体一类重要的细胞群体,在血管通透性屏障、免疫防御及炎症反应中起着极其重要的作用[1,2]。能够合成并分泌多种活性因子,其中IL-6、ICAM-1 较有代表性,而IL-6 则被认为是内皮炎症反应的最佳标志分子[2]。越来越多的研究表明,内皮细胞作为LPS 作用的靶细胞,在LPS 引起的脓毒症、脓毒性休克、多器官功能衰竭等病理过程中起着关键的作用,目前认为血管内皮功能障碍及凋亡不仅是心脑血管疾病发生的共同环节,而且是败血症、休克、创伤等应激情况下发生MODS 和ARDS 的重要原因。在ARDS

发生过程中,血管内皮细胞既是靶细胞也是效应细胞,它的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应及高通透性肺水肿的根本环节[1]。糖皮质激素(glucocorticoid,GC)对ARDS 的抗炎作用必然会以血管内皮细胞作为一个主要靶点,但长期以来有关糖皮质激素治疗ARDS 的研究多以临床观察为主,而一些涉及到血管内皮的基础研究则主要探讨白细胞与血管内皮的粘附及对内皮的损伤,而涉及到糖皮质激素作用机制的研究则主要在受体水平进行。有关糖皮质激素治疗ARDS 时对血管内皮保护的机制,特别是受体前调节机制的研究目前尚未见报道。 本实验以内毒素脂多糖LPS(lipopolysaccharide,LPS)致伤体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC) , 然后观察糖皮质激素(Dexamethasone,Dex)对HUVEC Roxadustat 受伤前后不同时点表达IL-6、ICAM-1 等细胞因子的影响,及HUVEC 发生凋亡的情况,以确定其对血管内皮的炎性损伤是否具有保护作用。然后用RT-PCR 等方法观察人脐静脉内皮细胞糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)、盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR)及糖皮质激素受体前调节的关键酶11β-羟基类固醇脱氢酶(11-βhydroxysteroid dehydrogenase, 11β-HSD)基因的表达变化,并观察11β-HSD 的经典抑制剂甘草次酸(glycyrrhizic acid,GA)在其中的作用。力图阐明糖皮质激素保护血管内皮炎性损伤的受体前调节机制,探讨其在ARDS

哪里 治疗中的意义。 主要研究结果和结论如下: 一、不同浓度LPS 刺激人脐静脉内皮细胞,在刺激3h 开始时即可使HUVEC
目的 观察角膜创伤愈合过程中,角膜上皮愈合情况及角膜纤维细胞活化增生情况;结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)及转化生长因子-β_1(Transforming Growth Factor-β_1,TGF-β_1)、Ⅰ型胶原和纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)的表达,TGF、CTGF对角膜创伤愈合的作用,并对二者之间的相互作用及与此有关的Smad信号传导通路做初步的研究。 方法 随即选择Albino纯种白兔35只,空白对照组:2兔4眼。单纯角膜创伤组:又分术后2小时、6小时、1天、3天、7天、14天、21天组,每组随即4眼。TGF抗体组:颞侧球结膜下注射15.5μgTGF抗体(经预实验选择得到的浓度)又分为3天、7天、14天、21天组,每组随即4眼。Smad_4抗体组:颞侧球结膜下注射20μgSmad4抗体;又分为3天、7天、14天、21天组,每组随即4眼。实验眼首先施一直径3毫米,包含0.05mm实质层的板层角膜切除术,TGF抗体组及Smad_4抗体组术眼球结膜下注射TGF-β_1抗体或smad4抗体。用免疫组化及mRNA原位杂交方法分别检测CTGF、TGF-β_1、FN蛋白术后2小时、6小时、1天、3天、7天、14天、21天的表达及Ⅰ型胶原、CTGFmRNA在术后6h、3天、7天、21天的表达;角膜上皮愈合情况及角膜纤维细胞活化增生情况。免疫组化所检蛋白、mRNA原位杂交所检mRNA表达强度用组织学评分∑pi表示,其中p代表阳性细胞数所占计数细胞百分比,I代表细胞染色强度。P和I均划分为0、1、2、3分。∑pi为阳性细胞数量和着色强度两项得分相加所得结果。每个角膜选3个切片进行免疫组化或原位杂交染色,每张切片随机选取3个视野(×400),共9个视野,分析结果进行
研究背景 血液流动对血管产生力的作用,这对于心血管系统稳态的维持有着重要的意义,这些力分为沿血流方向与血管平行的剪切力,垂直于血管壁的压应力和沿血管壁周向的拉应力。此外,它们也在心血管疾病,如动脉粥样硬化等的发生、发展过程中扮演着重要的角色。剪切力,作为血流动力的水平分量,不仅会影响内皮细胞的形态、迁移、分化和增殖,而且还通过调节内皮细胞不同基因的表达,在心血管系统的病理和生理过程中起重要作用。在内皮细胞,已发现多种受剪切力调节的基因,根据它们的生物学特性,大致可以分为血管活性物质、生长因子、粘附分子、趋化因子、凝血因子和原癌基因等。我们前期工作表明层流状态的低剪切力(4.

05)；与M组相比,MR组脊髓背角神经元凋亡率降低,且MD组脊髓背角神经元凋亡率升高(p
目的 (1)探讨维生素C体外诱导低分化胃癌细胞株MKN45凋亡的能力,(2)探讨氧化应激机制在维生素C诱导人胃癌MKN45细胞凋亡中的作用,(3)探讨维生素C诱导胃癌细胞株MKN45凋亡的可能相关机制。 方法 1、在体外培养的胃癌MKN45细胞株中加入不同浓度的维生素C(0.05mg/ml?0.1mg/ml?0.5mg/ml?1mg/ml?1.5mg/ml),并用H_2O_2特异性抑制剂过氧化氢酶单独和与能诱导MKN45细胞凋亡剂量的维生素C联合作用于MKN45细胞,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,观察维生素C对细胞生长活力的影响;应用荧光显微镜、Annexin V FITC/PI双染流式细胞术、DNA Ladder分析法检测细胞凋亡情况;应用化学显色法测定维生素C作用MKN45细胞株24h后细胞内氧化应激指标SOD活性、MDA含量的变化。用H_2O_2检测试剂盒检测DMEM培养基中H_2O_2水平。 2、应用分光光度法检测维生素C和过氧化氢酶作用前后MKN45细胞中Caspase-3活性的改变,RT-PCR法检测维生素C和过氧化氢酶作用前后MKN45细胞中Caspase-3基因、BCL-2基因家族mRNA表达水平的变化。

结果: 1、维生素C浓度在0.05mg/ml～0.5mg/ml之间,分别作用12、24、36小时后,MKN45细胞生长抑制率呈浓度依赖性,但生长抑制作用并不显著,且无明显时间依赖性。1mg/ml浓度的维生素C作用于胃癌MKN45细胞24小时后,可诱导MKN45凋亡,流式细胞术检测其凋亡率为31.4%,明显高于加入完全培养液的对照组凋亡率2.3% 也许 (P< 0. 05)。用过氧化氢酶(catalase)200 u /ml干预后,维生素C抑制MKN45细胞生长的作用明显减弱,细胞凋亡率由31.4%下降为6.3% ( P < 0. 05)。维生素C处理组SOD活性为272.00±31.77u/ml,对照组SOD活性为1224.00±52.32 u/ml,与对照组相比,细胞内的SOD活性明显下降( P < 0. 05),而维生素C处理组代谢产物MDA含量为80.00±13.06nmol/ml,对照组MDA含量为1.81±0.076nmol/ml,与对照组MDA相比,MDA明显增加( P < 0. 05)。 2、1mg/ml浓度的维生素C作用MKN45细胞24小时后,RT-PCR结果显示可诱导BAD基因表达明显增加及诱导BCL-2基因表达明显减弱,用过氧化氢酶干预后,维生素C诱导的BAD基因表达未见明显增加,而BCL-

很少 2基因表达也未见明显减弱(第二部分图1A)。1mg/ml浓度的维生素C作用MKN45细胞24小时后,未见BAX基因和BCL- XL基因表达的明显变化。用过氧化氢酶干预后的处理组和过氧化氢酶联合维生素C的处理组Caspase-3活性分别为0.0971±0.0025,0.0969±0.0019,1mg/ml浓度的维生素C作用MKN45细胞24小时后, Caspase-3活性升高至0.3760±0.0230,对照组活性为0.0968±0.0012,1mg/ml浓度的维生素C组Caspase-3活性与对照组相比具有显著的统计学意义(P
目的: 通过结扎大鼠冠状动脉左前降支(Left Anterior Descending, selleck产品 LAD)造成大鼠急性心肌缺血模型,观察缺血大鼠心肌组织中COX-2表达变化情况。通过给予选择性COX-2抑制剂帕瑞昔布,初步探讨COX-2在急性心肌缺血大鼠心肌组织中所发挥的作用。 方法: 一、为观察COX-2在急性心肌梗死大鼠心肌组织中表达的变化以及发挥的作用,分别取造模成功第2天至第7天的大鼠。测定心功能后迅速处死,取心肌组织,分别检测COX-2蛋白表达,梗死面积,细胞凋亡率。 二、为观察帕瑞昔布钠对心肌的保护作用,大鼠被分为:1、假手术组(Sham):只穿线,不结扎;2、模型组(AMI):AMI+生理盐水腹腔注射或生理盐水灌胃;3、帕瑞昔布钠低剂量组:AMI+Parecoxib

(ip.0.2 mg/kg/d);4、帕瑞昔布钠中剂量组:AMI+Parecoxib (ip.0.4 mg/kg/d);5、帕瑞昔布钠高剂量组:AMI+Parecoxib (ip.0.8 mg/kg/d)。从造模第3日至第7日给药,术后第8天检测大鼠心功能(LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax),测定心脏梗死面积, Bax和Bcl-2基因表达, COX-2、Bax、Bcl-2的蛋白表达,Caspase-3活化以及心肌梗死周边区细胞凋亡率。以观察给予帕瑞昔布钠治疗后,大鼠心肌组织损伤的变化情况。 结果: 1. COX-2蛋白在Sham组大鼠心肌组织中几乎不表达。与Sham组相比,大鼠冠脉左前降支结扎后心肌梗死周边区COX-2蛋白表达升高(P0.05),且这种改变具有一定的浓度依赖性。 4.心梗大鼠给予不同剂量帕瑞昔布钠五天治疗后,各组大鼠梗死面积有改变,但是差异不具有显著性意义(P>0.05)。 5.心梗大鼠给予不同剂量帕瑞昔布钠五天治疗后,大鼠梗死周边区细胞的DNA Ladder条带化程度减弱,且随着给药浓度的增加,心肌细胞Ladder条带化程度持续减弱。 6.心梗大鼠给予不同剂量帕瑞昔布钠五天治疗后,心梗周边区caspase-3的活化程度下降(P<0.05),且随着给药浓度的增加,caspase-3活化程度减弱,差异具有统计学意义(P<0.01);帕瑞昔布钠治疗组与AMI模型组相比,COX-2表达下降(P<0.05),并减小心肌梗死面积(P<0.

MTT法筛选氯化锂(LiCl)的有效干预浓度显示：2000mM、200mM LiCl能抑制SW480细胞增殖（P＜0.05）；而2mM LiCl在48h能促进该细胞增殖（P＜0.05），其他时间段未对细胞产生明显的生物学效果（P＞0.05）；而20mM氯化锂在三个时间段均未见明显的细胞增殖促进或者抑制效果（P＞0.05）。故选取20mMLiCl作为本实验有效干预浓度。

2. MTT法测定各实验组细胞的增殖抑制率显示：B、C组SW480细胞增殖抑制率上升（较A组P＜0.05），且两组间有差异性，48h抑制率最大（P＜0.05）；E、F组分别较B、C组细胞增殖抑制率下降（P＜0.05），但是两组间未见差异性（P＞0.05）。 AG14699 3.FCM结果显示：B、C组SW480细胞凋亡率上升，且组间有差异性，而且G0/G1期细胞增多（较A组P＜0.05）；E、F组分别较B、C组细胞凋亡率下降（P＜0.05），G0/G1期细胞数未见明显差异性（P＞0.05）。 4.1Western blot结果显示：B、C组非磷酸化β-Catenin蛋白表达明显下调（较A组P＜0.05），组间亦有差异性（P＜0.05）；E、F组非磷酸化β-Catenin蛋白表达明显上调（分别与B、C组比较P＜0.01），但组间无显著差异性（P＞0.05）；D组非磷酸化β-Catenin蛋白表达上调（较A组P＜0.05）。 4.2Western blot结果显示：B、C组非磷酸化GSK-3β、p-GSK-3β(Tyr216)蛋白表达明显上调（较A组P＜0.01），组间亦有差异（P＜0.05）；E、F组非磷酸化GSK-3β、p-GSK-3β(Tyr216)蛋白表达下调（分别与B、C组比较P＜0.05），但组间比较无显著性差异（P＞0.05）；D组非磷酸化GSK-3β、p-GSK-3β(Tyr216)蛋白表达下调（较A组P＜0.05）。 4.3Western blot结果显示：B、C组p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达有明显下调作用（较A组P＜0.05），组间亦有差异性（P＜0.05）；E、F组p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达上调（分别与B、C组比较P＜0.05），但组间无显著性差异（P＞0.05）；D组p-GSK-3β(Ser9)蛋白表达上调（较A组P＜0.05）。 结论： 1.奥曲肽能体外抑制结肠癌SW480细胞增殖和诱导其凋亡，并使其细胞周期受阻于G0/G1期；抑制GSK-3β活性可以减弱奥曲肽的抗癌效果。 2.奥曲肽对Wnt/β-Catenin信号通路的抑制作用，是通过激活GSK-3β的活性阻止信号传递实现的。
研究背景 心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion JQ1 injury，I/RI）是急性心肌梗死药物溶栓和介入治疗时常常伴随的重要病理生理过程，损伤会部分抵消由血管再通带来的临床受益，并且可能导致患者病情恶化，甚至死亡。目前临床对IR/I尚缺乏有效的防治手段。I/RI的机制复杂，近期研究发现微血管水平的病理变化是其重要的病理特征之一。Scarabelli的报道也证实心肌微血管内皮细胞（cardiac

microvascular endothelial cells，CMECs）在I/RI中具有关键作用，不仅因为CMECs凋亡的发生早于心肌细胞，而且很可能是促发心肌细胞损伤的始动环节[1]。研究表明，胰岛素可通过激活“PI3K/Akt/eNOS/NO细胞生存信号机制”抑制缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞和血管内皮细胞凋亡，从而发挥心脏保护作用[2,3]。然而胰岛素是否能够抑制CMECs凋亡，对抗IR/I，尚未有报道。 生存素(survivin，SVV)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中最小的成员，原来对于SVV的研究多集中在肿瘤的发生及治疗方面，随着研究深入，学者逐渐揭示SVV在心血管系统也具有重要作用，包括血管损伤的修复，平滑肌细胞增殖的调控，移植静脉的重构及血管发生等。我们前期的研究证实，胰岛素可通过上调心肌细胞SVV的表达，抑制缺血再灌注损伤诱导的心肌细胞的凋亡[4]。然而生存素是否在胰岛素对CMECs的保护作用中也发挥作用，及其机制尚不明确。 本实验旨在探讨胰岛素是否对缺血再灌注损伤过程中的心肌微血管内皮细胞有保护作用，并初步探讨SVV是否在胰岛素保护CMECs中发挥作用。 研究目的 1观察胰岛素对大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中的心肌微血管内皮细胞的功能和凋亡情况的影响。

TSA HADC 花费 2探讨胰岛素保护CMECs是否与上调SVV有关。 实验方法 分离培养大鼠CMECs，建立模拟缺血再灌注（simulated ischemiareperfusion，SI/R）模型，随机分为：(1)对照组（Control）；(2)模拟缺血再灌注组（simulated ischemia reperfusion，SI/R）：更换培养液为缺血液（NaCl137，MgCl20.49，KCl3.8，CaCl2·2H2O0.9，HEPES4，D-脱氧葡萄糖10，连二硫酸钠0.75，KCl12，乳酸20，mmol/L，pH6.5)，37℃缺氧孵箱内孵育2h，再更换正常细胞培养液，37℃5%CO2孵箱内孵育3h；(3)模拟缺血再灌注+胰岛素组（SI/R+Ins）：更换缺血液同上，再更换正常培养液的同时加入浓度为10-7mol/L的胰岛素。再灌注3h后采用MTT法检测细胞增殖能力，划痕实验检测细胞的迁移能力，TUNEL法检测细胞凋亡指数，western blot检测SVV蛋白表达。为进一步探讨SVV在胰岛素对CMECs保护中的作用，采用RNA干扰的方法抑制掉SVV的基因表达，通过蛋白质印迹的方法进行鉴定。CMECs随机分组：1）无转染组（Non-trasfected）；2）β-actin RNAi组；3）SVV RNAi组。各组转染48h后，分别给予Normal，SI/R和SI/R+Ins处理。用TUNEL法检测各组细胞凋亡指数。 实验结果 与对照组相比较，SI/R组和SI/R+Ins组CMECs的增殖能力明显降低（P<0.01），凋亡指数显著上升(P<0.01)，细胞迁移率上升(P<0.

采用TGF-β1诱导的乳鼠心肌成纤维细胞(CFb)增殖为实验模型,给予GBE和TGF-β1抑制剂进行干预,将实验分为五组A组:阴性对照组,药物同容积的细胞培养液;B组:TGF-β1作用组,TGF-β1(20

ng/m L)干预;C组:ALK5抑制剂(SB431542)作用组,SB431542(6mg/m 寻找更多 L)+TGF-β1(20 ng/m L);D组:GBE低剂量组,GBE(2mg/ml)+TGF-β1(2 0ng/m L),;E组:GBE高剂量组,GBE(20mg/ml)+TGF-β1(20 ng/m L)。采用MTT法和HE染色分析GBE对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞增殖及形态的影响;采用免疫组织化学分析各组大鼠心肌TGF-β1、I和III型胶原、MMP-2和MMP-9蛋白表达、以及TIMP1和TIMP2蛋白表达变化。2.采用Ang II诱导的乳鼠心肌细胞细胞凋亡为研究对象,给予GBE和ALK5抑制剂进行干预,将实验分为五组:A组:阴性对照组,药物同容积的细胞培养液;B组:Ang II作用组,Ang II(10-5 mol/L)干预;C组:ALK5抑制剂作用组,SB431542(6mg/m L)+Ang II(10-5 mol/L);D组:GBE低剂量组,GBE(2mg/ml)+Ang II(10-5 mol/L);E组:GBE高剂量组,GBE(20mg/ml)+Ang II(10-5 mol/L)。采用HE染色和倒置相差显微镜观察Ang II诱导大鼠心肌细胞心肌凋亡的形态学变化;流式细胞仪和原位末端标记技术(TUNEL法)检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况;采用实时荧光定量PCR和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测心肌凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2在细胞内m RNA及蛋白水平的表达。3.采用结扎大鼠左冠状动脉前降支建立大鼠急性心肌梗死(AMI)模型,术后将存活鼠分为5组(每组20只):假手术组(A组)、AMI模型组(B组)、AMI+阿司匹林10 mg/kg组(C组)、AMI+卡托普利20 mg/kg组(D组)、AMI+GBE 100mg/kg组(E组),分别干预至4周和8周。采用免疫组化和实时荧光定量PCR技术分别检测各组大鼠心肌Ⅰ型胶原、MMP-2和MMP-9蛋白表达以及TGF-β1、MMP-2和MMP-9 m RNA转录水平的表达变化。结果:1.与TGF-β1造模组比较,高浓度GBE组和SB431542组I、III型胶原蛋白表达显著减少(P<0.05);与TGF-β1造模组比较,高浓度GBE组MMP-2、MMP-9蛋白表达显著减少(P<0.05),SB431542组仅MMP-2蛋白表达显著减少(P<0.05);与TGF-β1造模组比较,SB431542组TIMP1、TIMP2蛋白表达均减少(P<0.05),高浓度GBE组仅TIMP1蛋白表达减少(P<0.05);B431542组和高浓度GBE组Bax基因表达下降(P<0.05);B431542组和高浓度GBE组Bcl-2基因表达上升(P<0.01),高浓度GBE组细胞内Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05),仅高浓度GBE组细胞内Bax蛋白表达显著降低(P<0.01);8周时,GBE、阿司匹林及卡普托利组Ⅰ型胶原蛋白表达水平较4周均明显降低(P
背景:研究已发现在许多人类的原发和继发肿瘤中,HGF依赖的自分泌c-Met(HGF受体)发生激活,包括乳腺癌,胶质母细胞瘤,骨肉瘤,黑素瘤等。非自分泌(旁分泌)的机制也能激活肿瘤细胞的转移性生长潜能。在原癌基因转化过程中,c-Met活性的调节可能与其在正常生理活动的信号通路中不同。c-Met的过度表达是潜在致癌因素,研究显示升高的c-Met水平和c-Met信号通路的功能激活能使正常成骨细胞发生转化。c-Met失调引起肺癌发生的两条重要途径是过度表达和基因突变。非小细胞肺癌和小细胞肺癌中都能发现c-Met过度表达。窄谱c-Met激酶抑制剂SU11274、PHA665752、XL880、XL184对肺癌显示潜在抑制活性,已进入临床试验。SIM-89是我国自主研发的小分子c-Met抑制剂,目前正在进行临床前研究。目的:初步探讨小分子c-Met抑制剂SIM-89的抑制酶谱,研究其对人肺癌细胞(A549、H460、H441、H1299、H1993)及小鼠黑色素瘤B16F10生长、迁移的抑制作用。观察其对裸鼠人肺癌移植瘤生长的影响。了解SIM-89抑制肿瘤细胞生长的相关作用机制,为进一步的体内试验及临床应用提供科学依据。方法:Z-lyte检测技术对SIM-89进行包括c-Met在内70种激酶酶谱筛选。对其中有较强抑制作用的激酶进行MOA分析。Real-time

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selleck 哪里 PCR法比较药物处理组和对照组细胞样本之间特定基因的表达差异。蛋白质免疫印迹法比较c-Met和p-Met表达情况的差异。ELISA法检测SIM-89干预后不同时间点以上细胞培养上清液的HGF浓度。CCK8法检测SIM-89作用于A549、H460、H441、H1299、H1993、B16F10细胞后,不同时间点(24h、48h、72h)的细胞活力。Transwell迁移实验观察药物对细胞迁移的抑制。A549、H460细胞裸鼠皮下注射建立人肺癌模型。B16F10裸鼠尾静脉注射建立裸鼠黑色素瘤肺转移模型。分别记录肿瘤生长曲线和裸鼠体重变化,割取肿瘤组织以免疫荧光组化法分析血管生长情况。结果:SIM-89对c-Met(IC50=297n M)、AMPK、TRKA(IC50=150.