0mmol/LLB的培养液处理,non-pretreated组用含2mmol/LLB的培养液处理。各组细胞经LB处理4h用流式细胞术检测细胞内ROS水平,四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazole-carbocyanide iodine, JC-1)检测线粒体膜电位,Western

blot法检测p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜检测线粒体内Cl-荧光强度,CCK-8法检测细胞活力,FCM和Hochest33258检测细胞凋亡率。同时,未用LB处理的各组细胞在相同时间点检测上述相同的指标作为对照。 计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0统计软件分析。细胞ROS含量、Cl-荧光强度、线粒体膜电位变化、细胞活力、细胞凋亡率、p38和p-p38MAPK蛋白表达量采用两因素析因设计资料方差分析。组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s Histone Methyltransferase抑制剂 T3法(方差不齐)。P<0.01)。流式细胞术检测线粒体膜JC-1荧光强度比值显示,DIDS组和DIDS+SB203580组分别为0.82±0.01和0.7±0.01,均高于non-pretreated组(0.52±0.01),差异均有统计学意义(P<0.01)。激光共聚焦显微镜检测线粒体内Cl-浓度显示,DIDS组和DIDS+SB203580组的Cl-浓度均低于non-pretreated组,差异有统计学意义(P<0.01),但均低于DIDS+SB203580组(P<0.01)。流式细胞术检测细胞凋亡率显示,LB处理后DIDS组、DIDS+SB203580组、SB203580组和non-pretreated组分别为23.4±1.58%、12.73±0.96%、24.53±0.93%和38.17±0.22%。Hoechst33258染色法检测显示,经LB处理后DIDS组、DIDS+SB203580组、SB203580组和Non-pretreated组的凋亡率分别为22.88±1.13%、12.45±0.74%、24.68±0.85%和37.8±0.99%。提示经LB处理后DIDS组.DIDS+SB203580组和SB203580组的凋亡率均低于non-pretreated组(P<0.01),DIDS+SB203580组的凋亡率低于SB203580组(P<0.01)。而鞘内注射LB组大鼠脊髓组织ROS水平均较未注射组水平显著升高(均有P<0.01)。而鞘内注射LB组大鼠脊髓背角浅层神经组织caspase-3阳性细胞数均较未注射组显著升高(均有P<0.01)。而鞘内注射LB组大鼠脊髓背角浅层caspase-9阳性细胞数均较未注射组显著升高(均有P<0.05)。而鞘内注射LB组大鼠脊髓p-p38MAPK蛋白表达水平均较未注射组显著升高(均有P<0.01)。而鞘内注射LB组大鼠脊髓背角浅层TUNEL阳性细胞数均较未注射组显著升高(均有P
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构退行性改变,骨的脆性增加,易于发生骨折为特征的全身代谢性骨骼疾病,多发于绝经后妇女及老年人。骨质疏松性骨折发病率高,严重威胁着人们的生命健康,并给社会和国家带来了沉重的经济负担。目前,用于治疗骨质疏松症的西药,如鲑鱼降钙素、双膦酸盐类和重组人甲状旁腺素等,具有明显的副作用且价格昂贵。因此,研究开发安全、高效、经济的抗骨质疏松症药物已成为目前的研究热点。据《神农本草经》记载,鹿角盘具有温补肝肾、强筋健骨、活血消肿等作用。

BMS-777607研究购买 经我们课题组前期的体内实验研究发现,鹿角盘微切助粉对去卵巢大鼠绝经后骨质疏松症模型有明显且良好的治疗效果。但是,关于鹿角盘防治骨质疏松症的作用机制至今仍未有报道。因此,本论文旨在系统地研究鹿角盘提取物对体外培养的成骨细胞骨形成功能和破骨细胞骨吸收活性的影响,并进一步探讨其防治骨质疏松症的作用机制。具体研究内容和结果如下： (1)采用微切变-助剂互作技术加工制备鹿角盘微切助粉。然后经粒径分析及扫描电镜观察分析细胞的破碎程度,并检测其中与骨质疏松症相关的活性物质的含量。

selleck公司 粒径分析及扫描电镜观察结果显示,经微切变-助剂互作技术处理后,鹿角盘微切助粉在粒径1-30μm范围内的颗粒数占82.73%,且细胞已被充分破碎,细胞内有效成分被暴露出来,呈释放的状态。活性物质含量分析结果显示,鹿角盘微切助粉中含有328.79士34.21pmol/L雌二醇、25.38士4.48nmol/L睾酮、17.56士3.45nmol/L孕酮,0.750±0.033μg/g类胰岛素生长因子-1,16.17±0.52mg/L柠檬酸钙和133.6±13.55mg/L钙,而不含有延胡索酸钙。且这些活性物质的含量均高于其粗粉,说明微切变-助剂互作技术增加了目标活性物质的溶出量,有利于鹿角盘中活性成分的释放,体现了该技术的优越性。 (2)以人类成骨样细胞MG-63为研究对象,系统地研究了鹿角盘提取物(水提物和醇提物)对成骨细胞生长、分化和矿化的影响及其防治骨质疏松症的可能作用机制。 LDH活性检测和细胞形态观察结果表明,鹿角盘提取物对成骨细胞没有细胞毒性作用。采用结晶紫试验、中性红吸收试验、台盼蓝排斥试验、MTT法和ALP活性检测考察细胞的生长和分化情况。结果表明,鹿角盘提取物不仅刺激了成骨细胞的生长和增殖,而且还促进了成骨细胞的分化。此外,茜素红-S染色和4-羟脯氨酸含量的检测结果显示,鹿角盘提取物是通过促进钙的沉积和增加Ⅰ型胶原蛋白的合成和分泌,促进矿化骨基质的形成,从而发挥促进骨形成的作用。采用ELISA法和RT-PCR分别检测了OPG和RANKL的蛋白含量和mRNA的表达量,结果显示,鹿角盘提取物极显著地增加了成骨细胞中OPG蛋白含量和OPG mRNA的表达量,而降低了RANKL蛋白含量和RANKL mRNA的表达量,提高了成骨细胞中OPG/RANKL的比值,间接地抑制破骨细胞的分化和成熟,从而起防治骨质疏松症的作用。 (3)以RAW264.

1过表达载体，经酶切鉴定及测序鉴定正确后转染胃癌细胞SGC7901及AGS，并采用Western-blot检测转染前后胃癌细胞ERp29表达水平变化。 结果：1.Western-bot结果：8对组织中有7对组织的ERp29蛋白在胃癌组织中表达下降，而另外1对标本ERp29在胃癌的表达水平则较高，结果分析显示ERp29在胃癌呈低表达具有统计学意义（p=0.032）。 2.RT-PCR结果：检测的8对组织中， ERp29在胃癌组织的mRNA表达水平均明显低于癌旁正常黏膜组织的表达，差异具有显著统计学意义（P＜0.05）。 3.组织芯片免疫组化结果：

（1）、ERp29在胃癌组织的表达水平明显低于癌旁正常黏膜组织的表达，其阳性表达率分别为47.1%、85.3%，差异有显著性（P=0.001）。 （2）、ERp29在胃癌中的表达与性别、淋巴结转移、TNM分期密切相关（P＜0.05），而与年龄、浸润深度、是否浆膜浸润、分化程度、血管侵犯、周围神经侵犯、组织学分型、肿瘤大小、腹膜种植及远处转移等临床病理参数无明显关系（P＞0.05）。 （3）、ERp29在男性胃癌患者及女性胃癌患者的阳性表达率分别为53.6%和28.9%，差异具有显著意义（P=0.004），且其表达与TNM分期、是否淋巴结转移、淋巴结转移数目呈负相关关系（P值分别为0.006、0.027、0.002）。 4.重组质粒ERp29-pcDNA3.1转染胃癌细胞后经western-blot验证，结果显示转染后胃癌细胞ERp29蛋白表达水平明显升高。 结论：1.ERp29在胃癌组织呈低表达。 2.ERp29是一个与胃癌淋巴结转移及TNM分期密切相关的潜在抑癌因子，在胃癌的发生、发展中起着重要的作用。 3.成功构建ERp29过表达载体。
目的 本课题研究瘦素（leptin）调控乳腺癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs）交互对话对乳腺癌侵袭转移的影响，并对其相关分子机制进行了探讨。 方法： 1.用PMA及IL-4处理THP1细胞，将其诱导成M2型巨噬细胞(M2macrophage)，倒置显微镜下观察细胞形态的改变，并用流式细胞术检测其分子表型（CD206、IL-10、IL-12及TGF-β）的改变。 selleck products 不 2.qRT-PCR及Western bloting法检测leptin作用的M2型巨噬细胞分泌的关键因子及其水平。 3.免疫荧光分析、qRT-PCR及Western bloting法检测leptin作用下M2型巨噬细胞中Ob-R的表达水平。 4.划痕试验和Transwell侵袭试验检测IL-8对乳腺癌MCF7、MDA-MB-231细胞迁移及侵袭的影响；用IL-8抗体中和leptin处理的M2型巨噬细胞-乳腺癌细胞共培养系统中的IL-8后，检测乳腺癌细胞迁移侵袭的变化情况。 5.采用qRT-PCR及Western bloting，用常用信号通路抑制剂处理，检测leptin作用M2型巨噬细胞分泌IL-8的相关信号通路（MAPK/ERK1/2和p38MAPK），并进一步验证这些通路的激活是通过leptin-ObR轴而启动。 6.免疫组织化学染色（IHC）检测人乳腺癌样本中CD68，Ob-R及IL-8的表达情况。 7.取6-8周Babl/c雌性裸鼠，在近右下肢乳腺脂肪垫处移植MDA-MB-231细胞，建立裸鼠乳腺癌移植模型；腹腔内注射Clophosome-Clodronate

Liposomes耗竭小鼠体内的巨噬细胞后，待肿瘤长至一定大小，瘤内注射leptin，观察肿瘤的生长情况、生存期及肿瘤肝肺转移情况；免疫组织化学染色检测肿瘤CD68，Ob-R及IL-8的表达情况。 结果： 1.采用PMA及IL-4将THP1诱导成M2型巨噬细胞，细胞由悬浮状态变为贴壁状态，且少数细胞伸出伪足；流式细胞术检测发现M2型巨噬细胞表面标志CD206为阳性，且与THP1相比，其IL-10及TGF-β为高表达，而IL-12为低表达。 2. Leptin作用使M2型巨噬细胞IL-8表达明显升高，且IL-8能促进乳腺癌MCF7及MDA-MB-231细胞的迁移及侵袭，而中和了M2型巨噬细胞-乳腺癌细胞共培养系统中的IL-8后，乳腺癌细胞的迁移及侵袭被明显抑制。 3.THP1及M2型巨噬细胞均表达Ob-R，且leptin作用下M2型巨噬细胞的Ob-R表达升高；Leptin能与Ob-R结合，激活M2型巨噬细胞MAPK/ERK1/2和p38MAPK信号通路，关键分子p-ERK1/2及p-p38表达明显升高，从而促进IL-8表达升高。 4.在人转移性乳腺癌样本中，CD68、Ob-R及IL-8的表达显著高于在良性乳腺样本和原位乳腺癌样本中。

5.在裸鼠乳腺癌移植模型中，leptin不仅促进乳腺肿瘤的生长和降低小鼠的生存期，而且肿瘤的肺转移可能与leptin促进TAMs分泌IL-8有关。 结论： 1.Leptin通过leptin-Ob-R轴，激活M2型巨噬细胞的MAPK/ERK1/2和p38MAPK信号通路，从而促进TAMs IL-8表达升高；leptin通过调控TAMs分泌IL-8，影响TAMs-乳腺癌细胞交互对话，从而促进乳腺癌的迁移及侵袭。 2.在人转移性乳腺癌样本中，TAMs的数量、Ob-R及IL-8的表达显著高于良性乳腺样本和原位乳腺癌样本。 Selleck Pifithrinα 3.在荷瘤裸鼠体内，leptin促进乳腺肿瘤的生长和降低小鼠的生存期。而且肿瘤的肺转移可能与leptin促进TAMs分泌IL-8有关。
目的探讨骨形态发生蛋白9对人肺腺癌细胞A549侵袭、迁移的影响及可能机制。 方法采用免疫组织化学方法检测BMP9和IL6蛋白在临床肺腺癌及其癌旁组织中的表达情况，以人肺腺癌细胞A549作为研究对象，用腺病毒BMP9感染A549细胞制备AdBMP9/A549细胞，把此组当成实验组。，用GFP腺病毒感染A549细胞，制备AdGFP/A549细胞，把这一组作为实验的对照组；把A549细胞未经腺病毒感染，作为空白对照组。实验采用逆转录PCR检测三组细胞BMP9mRNA的表达，同时采用Western blot检测三组细胞中BMP9蛋白的表达情况。通过细胞划痕实验﹑Transwell侵袭实验检测三组细胞迁移及侵袭的改变是否有差异，RT-PCR及Western blot检测被腺病毒BMP9感染后，IL6的mRNA和蛋白表达情况；同时用Western blot技术检测PI3K/Akt信号通路中总Akt和磷酸化Akt蛋白表达。 结果与癌旁组织相比，BMP9与IL6蛋白高表达于肺腺癌组织。具有统计学意义（p＜0.05）。A549细胞感染BMP9腺病毒后，AdBMP9/A549组的BMP9mRNA和蛋白的表达高于AdGFP/A549组和A549组。AdBMP9/A549组的划痕愈合率为(97.4±2.6)％，AdGFP/A549的划痕愈合率为(85.4±2.1)％。A549组的划痕愈合率为（.5±3.

人绒癌细胞系JEG-3生长在含10%的胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每2-3d换液一次。当细胞长至70-80%左右时用0.02%EDTA和0.25%胰酶消化液按1:3的比例进行传代。 2.JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于24孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分为空白对照组，2h

TGF-β1刺激组，6h TGF-β1刺激组。培养终止前2h和6h分别给予不同组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。每组设置3个复孔，用免疫荧光染色法对P-Smad的表达及核转位情况进行检测。 3. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分别为：空白对照组，TGF-β1刺激组，p38抑制剂（SB203580）1μM组，p38抑制剂（SB203580）3μM组， TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制剂（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用免疫印迹法检测各组细胞中Smad3以及P-Smad3的蛋白表达水平。 INCB018424分子重量 4. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分组情况如上所述。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制因子（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用实时定量PCR法检测smad3的mRNA表达水平。 OTX015小白鼠 结果： 1.在对照组中，P-Smad的表达成云雾状主要呈现在胞浆中，少量表达在细胞核。TGF-β1给予2h后，P-Smad3呈现胞浆胞核均表达。在TGF-β1给予6h后，P-Smad3主要表达在胞核，即TGF-β1给予6h，P-Smad3基本完成了由胞浆到胞核的核转位过程。

2．与空白对照组相比，TGF-β1刺激组的Smad3，P-Smad3蛋白表达增高(P<0.05)，而TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组中随TGF-β1受体阻滞剂浓度的升高，Smad3，P-Smad3的蛋白表达呈浓度依赖性降低(P<0.05)。与TGF-β1刺激组相比，p38抑制剂（SB203580）1μM组，p38抑制剂（SB203580）3μM组中随着抑制因子浓度的升高，Smad3，P-Smad3蛋白的表达亦呈浓度依赖性降低(P<0.05)。与其TGF-β1刺激组相比，随着抑制剂浓度的升高，TGF-β1受体阻滞剂组和p38抑制剂组中Smad3的转录表达水平逐渐降低(P
绒毛膜癌(choriocarcinoma CC)简称绒癌，是一种继发于正常或异常妊娠之后的滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tumor,GTT)。绒癌分为妊娠性绒癌（gestational choriocarcinoma，GC）和非妊娠性绒癌（non-gestational choriocarcinoma，NGC）两种。转化生长因子β1(transforming growth factor beta1, TGF-β1)是一种多功能多肽类细胞因子，因其能够调节细胞增殖、分化和凋亡，促进细胞外基质(ECM)形成，参与胚胎发育调节等，成为目前研究最多的参与滋养细胞侵入调节的细胞因子。其I型受体（TβR-I）和Ⅱ型受体（TβRⅡ）是跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶，TGF-β1与TβR-I/TβRⅡ结合后，使得下游Smads蛋白磷酸化，继而启动细胞内信号转导，调节细胞核内靶基因的转录而发挥其生物学效应。其中，TGF-β1、TβR或Smads任一环节元件异常，都可以引起TGF-β/Smads信号传导紊乱。

Pomalidomide数据表 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）信号转导通路是细胞内的主要信息传递系统，在人类已鉴定出四条MAPK通路，其中，p38MAPK通路在细胞恶变和肿瘤浸润转移过程中发挥重要作用。参与了调节多种肿瘤细胞中侵袭相关基因的表达。有些学者研究了在皮肤光老化的治疗中以及TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞的纤维化过程中Smad2/3与p38MAPK的相互作用，揭示了在多种疾病的发生机制中两条信号通路间的串话现象。c-myc基因是一种原癌基因，与细胞周期关系密切，一旦被激活，可通过对细胞的增殖作用，参与肿瘤的发生和发展。c-myc癌基因基因定位于染色体8q24，全长6-7kb，含3个外显子，编码蛋白由49个氨基酸残基组成，分子量达64/67kd。c-myc是细胞内多种信号通络下游的靶基因，c-myc蛋白作为转录因子，在调节细胞增殖、分化和凋亡方面发挥重要作用，它的过度表达可促进肿瘤细胞的生长[7]，因此，我们用MTT法观察了5ng/ml TGF-β1在不同作用时间下对绒癌JEG-3细胞的增殖的影响，寻找一个合适的不引起细胞增殖的时间点，用不同浓度的TGF受体Ⅰ、Ⅱ抑制剂（LY364947）和p38MAPK抑制剂（SB203580）作用JEG-3细胞，并通过qRT-PCR法检测JEG-3细胞中c-myc及TβRⅠ、 TβR Ⅱ mRNA的差异表达，以期进一步揭示绒癌的生物学转化机制。 目的：通过qRT-PCR法检测JEG-3细胞中c-myc及TβRⅠ， TβR ⅡmRNA的表达差异，以期探讨绒癌中TGF-β1介导的Smads与p38MAPK信号转导的相互作用，从而更深一步地揭示绒癌的恶性转化、侵袭和转移的分子机制。 方法：体外常规培养绒毛膜癌JEG-3细胞系，当细胞达到80%融合度后，用0.25%胰蛋白酶（含0.

9μM；采用基于荧光偏振原理的Hsp90抑制剂筛选模型对HDN-1进行评价，结果HDN-1不能与GA竞争性结合Hsp90，表明HDN-1不能与Hsp90N-端结合；通过观察HDN-1对胰蛋白酶水解Hsp90蛋白指纹图谱的影响，发现HDN-1与Hsp90N-端抑制剂17-AAG的作用不同，表明HDN-1确实不是作用于Hsp90N-端；进一步考察HDN-1与17-AAG联合应用对H1975细胞增殖的抑制作用，发现两者联用具有单独相加作用，说明HDN-1可能作用于Hsp90C-端；最后应用计算机分子模拟对接技术研究了HDN-1与Hsp90的结合部位，结果表明HDN-1与Hsp90分子的C-端结合。综上，HDN-1可与Hsp90结合，并且可能与Hsp90C-端发生结合。

Rho kinase 信号通路 第二部分：HDN-1对Hsp90相关功能的影响 1．细胞内Hsp90顾客蛋白超过200个，抑制Hsp90会引起顾客蛋白的降解。Western Blot方法检测HDN-1作用于3种非小细胞肺癌株H1975、A549、HCC827细胞对Hsp90顾客蛋白的影响，结果表明HDN-1引起了3种细胞中Hsp90顾客蛋白EGFR、p-EGFR、Stat3、p-Stat3、Raf、Akt、p-Akt、Erk、p-Erk、CyclinD1的降解和活性抑制。HDN-1在0.1μM浓度下就能引起吉非替尼耐药细胞株H1975细胞Hsp90顾客蛋白的变化，相比其它2种细胞，H1975细胞对HDN-1的作用更加敏感。 2．缺氧是肿瘤生长中普遍存在的现象，缺氧环境与肿瘤的发生密切相关，HIF-1α是参与该过程的重要转录因子。Hsp90通过与HIF-1α的相互结合可以起到促进HIF-1α的正确折叠、维持其在缺氧环境下稳定性的作用。为进一步证明HDN-1具有抑制Hsp90的作用，通过Western Blot方法考察HDN-1在缺氧条件下对H1975和A549细胞中HIF-1α含量的影响，结果表明HDN-1可以明显引起细胞内HIF-1α蛋白水平的下调。 3．研究显示，EGF介导的EGFR内吞降解与Hsp90密切相关，尤其是对发生突变的EGFR。该部分内容研究了HDN-1促进EGF介导的EGFR内吞降解的作用，结果发现：EGF可以诱导野生型EGFR的下调（A549细胞）但不能诱导突变型EGFR的下调（H1975和HCC827细胞），而HDN-1可以明显促进细胞中EGF介导的EGFR内吞降解，呈现剂量和时间依赖性，且对两种突变细胞中的EGFR作用更加明显，同时HDN-1也引起了3种细胞中p-EGFR（Tyr1045）含量上升，也具有剂量和时间依赖性，最后通过研究HDN-1对A549细胞中EGFR泛素化的影响，结果发现HDN-1引起A549细胞中EGFR泛素化增加。上述结果表明HDN-1通过抑制Hsp90的作用促进了EGF介导的EGFR内吞降解。

哪里 本部分实验表明，HDN-1引起三种细胞中多种顾客蛋白的降解具有剂量和时间依赖性，且对H1975细胞的作用最为明显，并且HDN-1引起HIF-1α蛋白水平的下调；HDN-1通过抑制Hsp90的作用促进了EGF介导的EGFR内吞降解，且对两种突变EGFR作用更加明显。综上，我们明确了HDN-1是一种新型Hsp90抑制剂，这也是首次发现多硫代二酮哌嗪类具有Hsp90的分子靶向作用。本文阐明HDN-1的Hsp90抑制作用揭示了HDN-1的抗肿瘤作用机制，也为今后进一步对这类化合物基于靶向Hsp90的分子优化与药物开发奠定了基础。
优势结构(privileged

而且 structures)的概念在1988年被Evans等首次提出,它是指能够与多种受体结合的单一分子骨架(A single molecular framework able to provide ligands for diverse receptors)。2000年Patchett和Nargund进一步阐述了优势结构的概念：通过合理的结构修饰,能够与多种受体结合的分子骨架称为优势结构,它具有“似先导化合物”、“似药”等性质。优势结构的概念被提出以后,以优势结构为骨架快速构建小分子化合物库,然后通过活性筛选寻找先导化合物的理念,吸引了药物化学家的极大兴趣。本论文的工作主要是围绕噻吩并嘧啶类小分子库的合成方法学研究和多样性导向的化合物库设计、合成及其相关生物活性的评价来展开的。 噻吩并嘧啶是典型的优势结构之一,许多生物活性化合物都含有噻吩并嘧啶结构单元。在本课题组前期对氯代嘧啶类化合物合成方法学研究的基础上,我们设计并合成了具有2-3个不同反应活性位点的噻吩并嘧啶砌块,作为构建该类小分子库的起始原料。基于多样性导向合成策略(DOS),通过亲核取代和Suzuki偶联反应,我们初步合成了一个含有130个化合物的噻吩并嘧啶小分子库1,并在蛋白激酶c-Met、腺苷受体A1R和PI3K等靶点上对这些化合物的生物活性进行了评价： 1)c-Met:结果表明库1中的绝大部分化合物不是很好的c-Met抑制剂。 2)A1R：化合物库1在腺苷受体A1R上初步发现了9个抑制率大于50%的阳性化合物,其中LXY-67是活性最好的化合物,在浓度是5μg/mL时,对腺苷受体A1R的抑制率为91.58%,在活性的基础上我们通过构效关系总结,合成了含有11个化合物的聚焦化合物库2,发现了活性优于LXY-67的化合物LXY-83,在浓度是5μg/mL时,其对腺苷受体A1R的抑制率为92.

培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells HUVEC),选择不同浓度和不同时间的ox-LDL进行处理后,采用Western Blot检测S1PR2的蛋白表达水平。2.培养人脐静脉内皮细胞,选择不同浓度的S1P进行处理24h后,采用Western Blot检测炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平,人Elisa试剂盒检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。3.以ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h后,分别用S1P(1μM),S1P(1μM)和VPC23019(S1PR1/3抑制剂,10μM),S1P(1μM)和JTE-013(S1PR2抑制剂,10μM)处理24

而且 h,采用Western Blot检测炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平,人Elisa试剂盒检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。4.以ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h后,分别以S1P(1μM),apo A-1(30μg/ml),apo A-1(30μg/ml)+BLT-1(10μM)以及ox-LDL60μg/ml的浓度处理转染了SR-BⅠ到人脐静脉内皮细胞24h后,用apo A-1(30μg/ml)处理24h后,采用Western 有 Blot检测SR-BⅠ,炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平,人Elisa试剂盒检测细胞培养液中TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。5.以ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h后,加入S1P(1μM)处理,再分别加入apo A-1(30μg/ml),apo A-1(30μg/ml)+LY294002(10μM)(PI3K抑制剂),apo A-1(30μg/ml)+MK2206(1μM)(Akt抑制剂),L-NAME(50μmol/L)(e

NOS抑制剂)处理24 h后,采用Western Blot检测PI3K,AKT的磷酸化水平;e NOS试剂盒检测NOS的活性;免疫荧光检测NF-κB的核转位。[结果]1.60μg/ml ox-LDL处理人脐静脉内皮细胞6h,S1PR2的蛋白表达水平达到最高。2.1μΜS1P处理人脐静脉内皮细胞24h后,炎症因子TNFα、IL-1β的蛋白的表达水平及培养液中水平达到最高。3.与ox-LDL60μg/ml处理培养的人脐静脉内皮细胞组相比较,S1P(1μM)组和S1P(1μM)和VPC23019(S1PR1/3抑制剂,10μM)组炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白的表达水平及培养液中水平显著提高。4.与ox-LDL60μg/ml处理培养的人脐静脉内皮细胞组相比较,S1P(1μM)组和apo A-1(30μg/ml)+BLT-1(10μM)组炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白的表达水平及培养液中水平显著提高。5.ox-LDL60μg/ml的浓度处理培养的人脐静脉内皮细胞6h,与S1P(1μM)+apo A-1(30μg/ml)组相比较,S1P(1μM)+apo A-1(30μg/ml)+LY294002(10μM)(PI3K抑制剂),S1P(1μM)+apo A-1(30μg/ml)+MK2206(1μM)(Akt抑制剂),S1P(1μM)+L-NAME(50μmol/L)组免疫荧光检测NF-κB的核转位水平显著降低。[结论]1.S1P对内皮细胞的炎症效应主要是通过S1PR2。2.SR-BⅠ抑制S1P/S1PR2对血管内皮细胞的炎症效应。3.SR-BⅠ抑制S1P/S1PR2对血管内皮细胞的炎症效应与PI3K–AKT-e 可能 NOS信号通路有关。
目的:明确TGF-β1是否诱导了人肝星状细胞LX-2中HMGA1基因的表达,是否活化ERK1/2和Akt信号通路,TGF-β1是否通过ERK1/2和(或)Akt通路促进HMGA1基因的表达。方法:1、以体外培养的LX-2作为研究对象,经血清饥饿处理后,加入终浓度分别为0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1孵育,24小时后收集细胞,提取LX-2细胞的总RNA,用Realtime-qPCR法检测各组细胞中HMGA1和HMGA2的mRNA表达情况。2、以5ng/ml的TGF-β1及ERK1/2和Akt通路抑制剂(分别为PD98059和MK2206)处理LX-2细胞,设正常对照组、TGF-β1刺激组、TGF-β1+DMSO阴性对照组、TGF-β1+PD98059(MK2206)处理组,采用western

blot检测各组细胞中pERK1/2、pAkt、ERK1/2、Akt的蛋白表达情况。3、用5ng/ml的TGF-β1及PD98059和MK2206处理LX-2细胞,设正常对照组、TGF-β1刺激组、TGF-β1+DMSO阴性对照组、TGF-β1+MK2206处理组、TGF-β1+PD98059处理组,采用Realtime-qPCR和western blot检测各组细胞中HMGA1的mRNA和蛋白表达情况。结果:1、随着TGF-β1剂量加大,HMGA1和HMGA2的mRNA表达水平逐渐升高,并在浓度为5ng/ml时达最高水平(P﹤0.05)。2、在LX-2细胞中TGF-β1显著促进了ERK1/2和Akt的磷酸化水平(P﹤0.05)。3、TGF-β1显著增加了HMGA1的蛋白和mRNA表达水平(P﹤0.05),并且PD98059能有效阻断TGF-β1对HMGA1的诱导作用(P﹤0.

细胞分组:分为4组,即15mmol/LGLU组(高糖组)、100μg/mLAGEs组(AGEs组)、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs组(高糖+AGEs联合组)及对照组。 5.细胞培养液上清TNFa水平检测:采用ELISA方法进行。 6.细胞培养液上清中MDA水平检测:采用硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid,TBA),严格按照试剂盒说明步骤检测。 7.RT-PCR法检测HO-1mRNA表达:提取总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),两步法进行RT-PCR,扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。 8.免疫印记(western blot,WB)法检测HO-1蛋白表达:提取总蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectropheresis,SDS-PAGE),电转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter,NC)封闭非特异位点。利用多克隆兔抗人HO-1抗体及HRP标记的二抗与NC反应,DAB显色后拍照分析条带亮度。 9.SB203580(SB,p38MAPK抑制剂)干预实验:分为高糖组、SB+15mmol/LGLU(SB+高糖)组、AGEs组、SB+100μg/mLAGEs(SB+AGEs)组。10μmo/LSB干预30min后换以含15mmol/LGLU或100μg/mL AGEs细胞培养液继续孵育24h,收集细胞进行RT-PCR检测HO-1mRNA表达水平。 10.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理;实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,相关分析采用积矩相关系数(Pearson相关系数)分析,检验标准为α=0.05。

也许 【结果】 1.制备的AGEs浓度:AGEs的荧光浓度为101.29U/mg,对照BSA的荧光浓度为13.68 U/mg,前者为后者的7.40倍。 2.GLU和AGEs刺激THP-1细胞的ROS产量:均表现为0.5h的ROS产量急剧升高,随着时间延长轻度下降,但于24h再度上升至较高水平,在6h、24h时间点的ROS产量表现为GLU和AGEs浓度依赖性升高。高糖组(65.88±1.61)和AGEs组(67.46±3.78)的ROS产量均显著高于对照组(41.95±1.36)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(107.21±8.94)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.01),且高糖和AGEs对ROS产量的影响具有协同作用(P＜0.05)。 3.细胞培养液上清的MDA水平(nmol/mL):高糖组(1.59±0.53)显著高于对照组(0.65±0.23)(P＜0.05),AGEs组(1.56±0.97)虽然也高于对照组,但统计学差异不明显(P＞0.05),高糖+AGEs联合组(3.26±0.32)显著高于GLU组和AGEs组(P＜0.05)。 4.细胞培养液上清的TNFa水平(pg/mL):高糖组(25.38±1.95)和AGEs组(24.43±2.65)显著高于对照组(14.97±1.49)(P＜0.01),高糖+AGEs联合组(51.25±1.72)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.001),高糖和AGEs对TNFa的影响存在协同作用(P＜0.001)。

什么 5.细胞HO-1mRNA的表达:高糖组(0.42±0.02)和AGEs组(0.48±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.001),高糖+AGEs联合组(0.89±0.12)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05)。 6.THP-1细胞的HO-1蛋白表达:高糖组(0.39±0.01)和AGEs组(0.45±0.03)显著高于对照组(0.15±0.01)(P＜0.05),高糖+AGEs联合组(0.81±0.02)显著高于高糖组及AGEs组(P＜0.05),高糖和AGEs存在协同作用(P＜0.01)。

7.相关分析:HO-1蛋白表达水平与HO-1mRNA、ROS产量、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。HO-1mRNA与ROS、MDA及TNFα均呈显著正相关(P＜0.001)。ROS产量与MDA、TNFα呈显著正相关(P＜0.001)。TNFα与MDA呈显著正相关(P＜0.001)。 8.SB203580(SB)(p38MAPK抑制剂)干预实验结果:各组之间HO-1mRNA表达均无显著的统计学差异(P＞0.05)。 【结论】 1.高糖和AGEs单独刺激能导致THP-1细胞氧化损伤加剧、分泌炎症因子TINFα水平及HO-1表达增高,二者联合刺激能使上述改变进一步加剧。 2.p38MAPK抑制剂对高糖和AGEs诱导的THP-1细胞HO-1mRNA表达无显著影响。 3.HO-1表达与细胞氧化损伤及炎症指标呈显著正相关,提示高糖和AGEs导致THP-1细胞氧化损伤及炎症反应,后者诱导HO-1表达适应性和代偿性增高,从而发挥细胞保护作用。 第二章抑制HO-1对高糖和AGEs致THP-1细胞氧化应激的影响 【目的】 探讨抑制HO-1表达对高糖和AGEs刺激下THP-1细胞氧化应激的影响。 【方法】 1.细胞分组:分为4组,即对照组、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(GLU+AGEs)组、ZnPP组及ZnPP+15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs(ZnPP+GLU+AGEs)组,其中对照组和ZnPP组THP-1细胞培养液的GLU浓度均为5mmol/L。 这个 2.细胞ROS产量、细胞培养液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表达水平检测同第一章。 3.统计学处理:用SPSS13.0软件对所有数据进行统计学处理。实验数据计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间资料比较用析因设计的方差分析(ANOVA),任意两组间比较采用独立样本的t检验,检验标准为α=0.05。 【结果】 1.各组细胞ROS产量(MFI)的比较:ZnPP+GLU+AGEs组(128.81±5.53)、GLU+AGEs组(107.21±8.94)和ZnPP组(51.56±2.09)均显著高于对照组(41.95±1.36)(P＜0.05),而ZnPP+GLU+AGEs组显著高于GLU+AGEs组及ZnPP组(P＜0.05)。 2.各组细胞培养液上清MDA水平(nmol/mL)的比较:ZnPP组(1.61±0.10)、GLU+AGEs组(3.26±0.32)、ZnPP+GLU+AGEs组(3.75±1.25)的MDA水平均显著高于对照组(0.65±0.23)(P＜0.01),其中ZnPP+GLU+AGEs组显著高于ZnPP组(P＜0.05),但与GLU+AGEs组相比无显著性差异(P＞0.05)。 3.各组细胞培养液上清TNFa水平(pg/mL)的比较:ZnPP组(27.34±10.18)、GLU+AGEs组(38.09±14.97)、ZnPP+GLU+AGEs组(141.10±12.

5,1.0,2.0mmol/L MT的RPMI1640培养液培养24 h,然后移去含MT的RPMI1640培养液,加入含10mg/Lox-LDL的RPMI1640培养液继续培养24h。Western blot检测细胞内Akt、磷酸化Akt的蛋白表达时加上以下两组:(4)Wortmannin组:EPCs培养24h后,换用含Wortmannin 100μmol/L RPMI1640培养液继续培养24h;(5)MT+Wor+ox-LDL组:先用含1.0mmol/L MT的RPMI1640培养液培养24h,然后移去含MT的RPMI1640培养液,换用含Wortmannin 100μmol/L、ox-LDL10mg/L的RPMI1640培养液继续培养24h。采用MTT法检测EPCs增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率;提取细胞RNA,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测Bcl-2mRNA表达;采用免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白表达水平;采用Western Sorafenib blot检测磷酸化Akt的蛋白表达。 结果:

1.Ox-LDL显著减少EPCs增殖、诱导EPCs凋亡,同时使Bcl-2mRNA和蛋白的表达下降,并降低磷酸化Akt的表达; 2.PI3K特异性抑制剂Wortmannin处理EPCs后,磷酸化Akt的表达不明显; 3.MT预处理EPCs能够抑制ox-LDL所导致的凋亡率增加、增殖减少,能够上调Bcl-2mRNA和蛋白的表达,增加磷酸化Akt的表达。 结论:Ox-LDL抑制EPCs增殖、诱导EPCs凋亡的作用是通过抑制Akt活化,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2实现的;MT能上调磷酸化Akt蛋白及凋亡抑制蛋白Bcl-2水平,抑制ox-LDL的作用;Ox-LDL的作用机制至少部分是依赖PI3K/Akt信号通路实现的。 第三章美乐托宁对冠心病患者循环血中EPCs增殖与凋亡影响的体外研究 美乐托宁(melatonin,MT)又名褪黑素,是松果体分泌的激素,许多研究表明MT是体内强自由基清除剂和抗氧化剂,能通过清除自由基保护机体免受氧化损伤,从而抑制细胞死亡或凋亡的发生。越来越多的研究显示,MT及其抗氧化作用与心血管疾病关系密切;而EPCs在内皮损伤后的修复中、在缺血组织的血管新生过程中起重要作用,与心血管疾病密切相关,但MT对EPCs分化的影响及其可能的机制迄今尚未见公开报道。本课题的前期工作表明:MT预处理人脐静脉血EPCs能够抑制ox-LDL所导致的凋亡率增加、增殖减少,能够上调Bcl-2mRNA和蛋白的表达,增加磷酸化Akt的表达。在此基础上,本研究通过体外培养的冠心病患者循环血EPCs,拟观察MT对冠心病患者循环血中EPCs增殖、凋亡与功能的影响,以探讨MT对冠心病患者EPCs的保护作用及其可能的细胞机制。

无 目的:探讨抗氧化剂美乐托宁对冠心病患者循环血中EPCs增殖与凋亡的影响及其机制。 方法:选择性冠状动脉造影确定冠心病患者36例,密度梯度离心法获取冠心病患者外周血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞分成4组:(1)空白对照组:先用不含胎牛血清的RPMI1640培养液培养24h,然后换含胎牛血清的RPMI1640培养液;(2)MT各浓度组(共3组):不含胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h后,分别换用含0.5,1.0,2.0mmol/L MT的条件培养液培养(6、12、24和48)h。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPCs,分别观察EPCs的迁移、粘附能力,采用MTT法检测EPCs增殖能力,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用RT-PCR技术检测Bcl-2mRNA表达,采用western blot检测Bcl-2的蛋白表达。 结果: 1.MT显著改善体外培养的冠心病患者外周血EPCs的粘附、迁移和增殖能力,作用呈浓度和时间依赖性; 2.MT抑制体外培养的冠心病患者外周血中EPCs的凋亡,作用呈浓度和时间依赖性; 3.MT上调EPCs内Bcl-2mRNA和蛋白的表达。 结论:MT能改善体外培养的冠心病患者外周血EPCs的粘附、迁移和增殖能力,并通过上调凋亡抑制基因Bcl-2而发挥抑制EPCs凋亡的作用。
第一章腹脂素对内皮细胞ICAM-1表达的影响

不 背景 腹脂素是一种新发现的脂肪细胞因子,在肥胖、糖尿病以及高血压患者体内有显著升高。体外实验发现腹脂素能促进单核细胞、脂肪细胞等多种细胞分泌TNF-a、IL-1β和IL-6等炎症因子;腹脂素也能促进单核细胞表达ICAM-1和促进内皮细胞表达VEGF。而脂肪细胞和单核细胞也能分泌表达腹脂素。腹脂素在颈动脉粥样硬化斑块和冠脉斑块上表达丰富,且有缺血性症状者的腹脂素水平高于无症状者,这些提示腹脂素很可能和动脉粥样硬化病变发展有关。腹脂素能通过激活内皮ERK_((1/2))信号途径促进细胞表达VEGF,而既往有研究发现激活内皮细胞ERK_((1/2))能促进粘附分子ICAM-1的表达。内皮细胞ICAM-1表达增加会促进单核细胞粘附于内皮加速动脉粥样硬化进展。我们推测腹脂素可能通过激活内皮细胞的ERK_((1/2))信号通路促进粘附分子ICAM-1的表达而影响动脉粥样硬化病变的进展。 目的 观察腹脂素单独或者协同ox-LDL、葡萄糖对内皮细胞表达ICAM-1以及对内皮-单核细胞粘附的影响。 方法 采用HUVEC内皮细胞株传代3-6代时处于对数生长期的细胞作为研究对象。观察细胞:(1)腹脂素(100ng/ml～800ng/ml)干预内皮细胞24小时或者ERK_((1/2))抑制剂PD98059预先干预细胞30分钟后再予腹脂素干预细胞24小时,细胞ICAM-1和ERK_((1/2))表达的变化;(2)腹脂素(100ng/ml～800ng╱ml)和ox-LDL(40ug╱ml)协同刺激内皮细胞24小时或者ERK_(1/2)抑制剂PD98059预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和ox-LDL协同刺激细胞24小时,细胞ICAM-1和ERK_(1/2)表达的变化;(3)腹脂素(100ng╱ml～800ng/ml)和葡萄糖(30mmol╱l)协同刺激内皮细胞24小时或者ERK_(1/2)抑制剂PD98059预先干预细胞30分钟后再予腹脂素和葡萄糖协同刺激细胞24小时,观察细胞ICAM-1和ERK_(1/2)的表达变化;(4)上述腹脂素不同干预对单核细胞和内皮细胞粘附的影响。通过检测细胞ICAM-1mRNA和蛋白表达变化来观察腹脂素、腹脂素+ox-LDL或者腹脂素+葡萄糖对内皮细胞ICAM-1表达的影响,以及ERK_(1/2)信号途径在腹脂素影响内皮细胞表达ICAM-1中的作用。 结果 1.

Thus, an ongoing, large-scale effort is underway to develop clinically active drugs that target elements of the PI3K pathway. However, conflicting data suggest that gain-of-function PIK3CA mutations may be associated with either a favorable or a poor clinical outcome, compared with the wild-type PIK3CA gene. In the current study, we performed a systematic review of breast cancer clinical studies. Upon evaluation of 2587

breast cancer cases from 12 independent studies, we showed that patients with tumors harboring a PIK3CA mutation have a better clinical outcome than those with a wild-type PIK3CA gene. Importantly, this improved prognosis may pertain only to patients with mutations in the kinase domain of p110α and to postmenopausal women with MLN2238细胞系 estrogen receptor-positive breast cancer. We propose three potential explanations for this paradoxical observation. First, PIK3CA mutations may interfere with the metastasis process or may induce senescence, which results in a better

outcome for patients with mutated tumors. Secondly, we speculate that PIK3CA mutations may increase early tumor diagnosis by modification of the actin cytoskeleton in tumor cells. Lastly, we propose that PIK3CA mutations may be a favorable predictive factor for response to hormonal Erlotinib体内 therapy, giving a therapeutic advantage to these patients. Ultimately, an improved understanding of the clinical

impact of PIK3CA mutations is critical for the development 什么 of optimally personalized therapeutics against breast cancer and other solid tumors. This effort will be important to prevent or explain therapeutic failures and select patients who are most likely to respond to new therapies that inhibit the PI3K pathway.
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT/PKB)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导通路可抑制肿瘤细胞凋亡、促进细胞生存、调节细胞周期,促进肿瘤新生血管的形成以及侵袭与转移,在肿瘤的发生、发展、治疗及转归中发挥着重要作用。而近来研究发现此信号通路与乳腺癌的关系非常密切,使之成为乳腺癌新的治疗靶点及研究热点。临床前研究已经证实,PI3K抑制剂及mTOR抑制剂通过不同的作用靶点作用于PI3K/AKT/mTOR信号传导通路上,从而达到抗癌的作用。PI3K抑制剂中有些药物只作用于PI3K靶点,有些作用于PI3K和mTOR双靶点,且现阶段的研究更倾向于进行针对不同PI3K亚型的分子靶向药物的研究,以达到对PI3K通路的抑制作用更具有针对性和特异性的目的,其在临床上的作用和疗效需要进行进一步的研究。而mTOR抑制剂针对的作用靶点是mTORC1,是PI3K/AKT/mTOR通路中开发较为完善的分子靶向药物,雷帕霉素衍生物类药物已经在乳腺癌中进行Ⅱ/Ⅲ期临床试验,且该类药物在联合乳腺癌内分泌治疗药物或人表皮生长因子受体-2(Her-2)靶向治疗药物治疗转移性乳腺癌中取得了良好的疗效。
目的设计合成一系列6-取代亚甲肼基嘧啶及三嗪衍生物,并对其体外抗肿瘤活性进行初步评价。方法以2,4,6-三氯嘧啶或三聚氯氰、苯胺、苯并咪唑、吡咯为起始原料,经多步反应合成目标化合物;采用MTT法,以BMCL-200908069-1为阳性对照药,以H460、A549和H226为测试细胞株,对目标化合物进行抗肿瘤活性评价。结果合成了20个未见文献报道的6-取代亚甲肼基-2,4-双吗啉嘧啶及三嗪类化合物,其结构经MS、1H-NMR谱确证。结论体外活性实验显示:该系列化合物具有较强的抗肿瘤活性,其中,化合物6a活性最佳,其对H460、A549和H226抑制作用的IC50值分别为3.4、0.75、0.86μmol.L-1,其活性为阳性对照药的2.8～16.

GSK-3β抑制剂对肝癌细胞内p-GSK-3β分布的影响: 目的:通过抑制GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移过程中的影响。方法:应用药理学方法,以GSK-3β特异性的抑制剂LiCl抑制Hep3B细胞中GSK-3β的活性,通过细胞组化观察其对肝癌细胞迁移过程中p-GSK-3β在胞内分布的影响。结果:在正常培养的条件下,肝癌细胞发生迁移3h后,细胞内p-GSK-3β呈现出在细胞前沿边缘附集的现象,而加入GSK-3β的抑制剂LiCl后,p-GSK-3β的分布未呈现这种边缘附集的现象。结论:在肝癌细胞迁移过程中,p-GSK-3β呈现出一种不对称分布的现象,且这种不对称与细胞迁移的方向一致。应用GSK-3β的抑制剂后,肝癌细胞内p-GSK-3β的这种不对称分布的现象被破坏,同时影响了肝癌细胞的迁移速度以及方向。

5.抑制GSK-3β活性对肝癌细胞极性的影响: 目的:通过抑制GSK-3β活性观察其对肝癌细胞迁移方向的影响。方法:应用药理学方法,以GSK-3β特异性的抑制剂LiCl和SB216763分别抑制SMMC-7721和Hep3B细胞中GSK-3β的活性,通过微管组织中心体(MTOC)实验检测不同活性状态下肝癌细胞的迁移方向的差别。结果:未加入抑制剂时,Hep3B细胞MTOC阳性率在60%以上,其中DMSO组为62.76%,NaCl组为61.22%。而应用GSK-3β抑制剂后,MTOC阳性率明显下降,SB216763组降为31.17%,LiCl组降为29.09%。且具有统计学意义。结论:GSK-3β的活性被抑制后,不仅肝癌细胞迁移的速度被抑制,细胞的极性化也被打乱,影响了细胞迁移方向的决定,呈现出运动方向的随机化。
商陆皂甙甲(Esculentoside 并且 很少 A,EsA)是中药商陆中含量最高的皂苷。近二十多年的研究表明EsA具有广泛的药理作用。前期研究发现商陆皂甙甲有显著的抗炎免疫作用,EsA能抑制淋巴细胞和巨噬细胞释放多种细胞因子和介质,如白介素-1(Interleukin -1,IL-1)、白介素-2(Interleukin -2,IL-2)、白介素-6(Interleukin -6,IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)、前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)、血小板活化因子(Platelet activating factor, PAF)、免疫反应性纤维结合素(Immunoreactive

fibronectin-γ,IFN-γ)和一氧化氮(Nitric Oxide,NO)等,而这些因子在炎症和免疫反应中都起到重要的作用。同时,EsA能够抑制巨噬细胞的吞噬作用,并对小鼠的自身免疫性疾病有作用。基因芯片结果显示EsA可能通过对NO、金属蛋白酶、转化生长因子-β(Transforming growth factor,TGF-β)、免疫亲和素等相关的基因靶群的调节而起抗炎及免疫调节作用。 糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase

3β,GSK3β)是一种使糖原合成酶磷酸化的多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,能调节许多细胞功能,包括细胞的生长,代谢,基因转录,蛋白翻译,细胞骨架组构、细胞周期进程以及细胞的脱噬作用等。最近研究发现GSK3β还能调控炎症过程,可能与老年性痴呆、糖尿病和肿瘤等疾病有关。此外,GSK3β还参与白介素-10(Interleukin -10,IL-10)和TNF等多种细胞因子和炎症介质表达的调节。Nitric oxide (NO)在心血管,免疫以及神经系统中是一个重要的信使分子, PIN可与NO合酶NOS特异性的结合,此外研究发现PIN与细胞骨架蛋白LC8为同一物质,能与转录调节子IκB,促细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白Bim等相互作用,来调节许多细胞功能,包括细胞周期的调控,细胞的脱噬作用以及细胞极性的维持。 点击此处 本研究从ESA抗炎免疫调节作用相关基因靶群中挑选了glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β,AF156099)和protein inhibitor of nitric oxide synthase (PIN,AF020185)两条生物学功能尚不十分清楚的基因,克隆GSK3β和PIN全长cDNA,构建表达载体,然后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,研究GSK3β和PIN高表达对小鼠巨噬细胞功能的影响,包括巨噬细胞吞噬功能、细胞因子(IL-1、IL-6、TNF)和炎症介质NO释放,从而证明其在炎症和免疫中的作用。 主要研究结果如下: (1)构建了pcDNA3.1-GSK3β和pcDNA3.1-PIN真核表达载体,脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,G418筛选获得GSK3β和PIN高表达细胞系;采用Western Blot方法验证发现,RAW264.7细胞转染pcDNA3.1-GSK3β后GSK3β表达显著高于细胞转染pcDNA3.1质粒对照。 (2)采用中性红染色法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的吞噬功能,结果显示高表达GSK3β和PIN能够抑制RAW264.7细胞吞噬功能; (3)采用Griess法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的上清中一氧化氮(NO)含量,结果显示高表达GSK3β和PIN能够显著抑制LPS刺激RAW264.7细胞产生NO; (4)采用结晶紫染色法测定GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞的上清中的肿瘤坏死因子(TNF)活性,结果显示高表达GSK3β和PIN能够显著促进LPS刺激RAW264.7细胞产生TNF; (5)采用Western Blot方法,分析GSK3β和PIN高表达的巨噬细胞中相关抗炎免疫因子IL-1,IL-6的蛋白表达的变化,结果显示GSK3β和PIN高表达显著促进LPS刺激RAW264.

05),A+L组大鼠海马IL-1β蛋白表达明显高于L组和A组,差异有统计学意义(P
目的研究早期乳腺癌保乳手术术中电子射线照射对保乳患者伤口引流液内GRO-1和VEGF的影响。 可能 方法将60例保乳手术患者分为对照组和试验组,每组30人,对照组患者单纯行保乳手术患者,试验组患者行保乳手术患者并辅以术中电子射线照射。收集两组患者术后24小时伤口引流液。应用ELISA方法检测引流液内的GRO-1和VEGF的含量。 结果对照组患者引流液内的GRO-1和VEGF的含量分别为: 50.08±14.09pmol/l和427.16±20.18ng/l,两者在表达上呈正相关性(r=0.817,P<0.05)。和对照组相比,试验组内GRO-1和VEGF两者的含量均明显下降(P
目的:观察关节腔内注射HA对兔内侧半月板全部切除术后OA关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达及细胞凋亡的影响。

方法:选取健康成年新西兰大耳白兔30只,随机分为三组:假手术组(A组)6只;HA实验组(B组)12只;模型组(C组)12只。除A组6只行双膝关节囊切开外,其余24只(B组和C组)行右膝关节内侧半月板全部切除术制模,术后第4周开始,B组右膝关节内注射透明质酸0.5 m L,A组和C组于相同时间相同方法注射等量的生理盐水,每周1次,连续5次。于末次给药后两周(术后11周),采用空气栓塞法处死全部兔子,取股骨内髁软骨面标本行大体和光镜组织学观察,原位细胞凋亡(TUNEL)技术检测软骨细胞凋亡,免疫组织化学和Western-blot手段检测软骨细胞iNOS蛋白表达水平。 结果:(1)软骨标本大体观察:A→C组软骨标本大体评分逐渐升高,B组软骨标本评分为(1.25±0.45),明显低于C组评分(3.08±0.29),差异有统计学意义(P<0.01)。(2)光镜组织学观察:C组可见关节软骨表面纤维化,甚至形成糜烂、溃疡,表层软骨细胞排列紊乱,细胞数量明显减少,中层细胞呈特征性簇状排列,软骨空陷窝数增多,软骨空陷窝率为(22.75±2.70)%,B组软骨表层略不平整,细胞排列欠规整,部分软骨细胞簇聚成团,软骨空陷窝率为(15.91±3.03)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。(3)TUNEL法测试细胞凋亡:A→C组凋亡指数逐渐升高,B组凋亡指数为(13.42±2.57)%,低于C组(21.83±2.12)%(P<0.01)。(4)细胞iNOS蛋白表达:A→C组iNOS免疫组化染色阳性率和Western-blot检测的蛋白相对表达量逐渐升高,B组免疫组化阳性细胞率为(26.83±6.69)%,低于C组(41.83±4.17)%,Western-blot检测B组iNOS蛋白相对表达量为(2.69±0.23),低于C组(3.60±0.18)%,两者比较差异均有统计学意义(P
目的研究p38MAPK抑制剂CBS3830在大鼠自体静脉移植动脉化中抗炎及抗增生作用,进一步探讨p38MAPK信号通路在静脉移植动脉化、内膜增生、静脉桥狭窄中的机制,为阻止内膜增生、预防静脉桥狭窄的靶向治疗提供新的途径。

INK1197订单 方法SD大鼠50只,随机分为四组:正常对照组(n=10)、假手术组(n=10)、药物对照组(n=10)及药物组(n=20)。采用改良cuff法建立自体静脉移植动脉化模型,分别于0h、24h、48h、4d、1w及2w时点采取血液标本,分别于0h、1w、2w及4w时点获取血管标本。酶联免疫吸附法(ELSIA)检测大鼠血清中TNF-α及IL-1β水平;免疫组织化学染色检测各组大鼠血管标本中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;HE染色法观察各组大鼠血管内膜病理变化。

http://www.selleckchem.cn/products/jq1.html 结果药物组TNF-α水平在24h最高,48h~2w呈逐步下降趋势,与药物对照组比较有显著统计学差异(p<0.01),与假手术组比较有统计学差异(p<0.01);药物组IL-1β水平在24h最高,48h~4d呈逐步下降趋势,与药物对照组比较有显著统计学差异(p<0.01),在4d降至最低,4d~2w水平再次升高,与药物对照组、假手组比较有统计学差异(p<0.01);药物组血管PCNA表达1w时明显升高,是正常对照组的9倍,,2w时达高峰,4w开始下降,各时间点明显低于药物对照组(p
目的:探讨异丙酚对老年患者术后早期认知功能改变与炎性细胞因子的影响及其可能机制。 方法:选择ASAⅠ～Ⅱ级行开腹胃癌根治术的老年患者60例,随机分为2组,Ⅰ组为七氟烷吸入麻醉组,Ⅱ组为异丙酚全凭静脉麻醉组,Ⅰ组使用七氟烷吸入诱导和术中维持;Ⅱ组使用异丙酚TCI泵靶控输注诱导和术中维持。记录两组患者入室后、术中、术后血流动力学指标以及手术时间、苏醒时间、出血量、尿量、输液量及BIS值。所有患者均分别于诱导前、手术开始后4h、术后24h、术后48h抽取外周静脉血,用ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-a、IL-10浓度。两组患者均于术前、术后第2天采用韦氏成患者记忆量表及智力量表进行神经精神功能测试。 结果:两组术前、术中、术后一般情况相比差异均无统计学意义(P>0.05)。两组四种细胞因子在T1、T2、T3较T0均升高(P0.05);IL-1β在T1、T2和T3两组相比无明显差异(P>0.05);Ⅱ组IL-6、IL-10在T1、T2、T3比Ⅰ组低(P<0.05);TNF-aⅡ组在T1、T2比Ⅰ组低(P0.05)。术后韦氏成患者记忆量表及智力量表各个单项测试中,联想学习、累加、视觉再生测试中两组的测试成绩与术前相比差异均有统计学意义(P<0.05),在数字广度一逆向测试中,Ⅰ组的成绩较术前明显下降(P0.05),其它各项测试术后与术前相比无明显改变(P>0.05)。在两组术前术后各测试得分差(X值)的比较中,累加、联想学习、数字广度一逆向测试Ⅱ组与Ⅰ组相比均有统计学意义(P0.05)。POCD的发生率Ⅰ组为25.0%,Ⅱ组为13.79%,两组之间差异无统计学意义(P>0.