将构建成功的重组腺病毒载体Ad5-Wnt-3a转染Jurkat细胞，筛选出最适转染滴度MOI＝60，转染率为(42.54±1.63)%。 2.Wnt-3a转染后，实验组有效表达Wnt-3a基因；GSK-3β总蛋白的表达量显著下调；β-catenin蛋白表达量明显上调，为对照组的2.38倍；细胞增殖明显，增殖率约为21.2%，细胞G0/G1期下降，S期升高，未见明显细胞凋亡。 3.RT-PCR检测结果显示实验组细胞内c-myc和cyclin D1mRNA表达分别为（0.75±0.04）和（0.75±0.03），相比空载体组，表达水平的增高具有统计学意义。而Survivin mRNA表达水平未见明显改变。 结论 腺病毒介导的Wnt-3a抑制Jurkat细胞中GSK-3β蛋白的表达，同时可激活细胞内经典Wnt/β-catenin信号途径，活化的β-catenin促进Jurkat细胞增殖与细胞周期改变，未见明显细胞凋亡，可能的机制是通过上调下游靶基因c-myc和cyclin
D1的表达实现。 第三部分抑制GSK-3β活性对儿童急性淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞凋亡的机制研究 Palbociclib小白鼠 目的 以ALL患儿原代细胞为实验细胞，通过抑制剂氯化锂（LiCl）和SB216763抑制GSK-3β活性后，进一步探讨GSK-3β介导的Wnt/β-catenin与NF-κB信号通路诱导ALL细胞凋亡的分子机制。 方法 分别应用LiCl和SB216763抑制ALL细胞内GSK-3β，经过体外短期培养，①Western blotting方法检测ALL细胞中GSK-3β及其下游信号分子β-catenin与NF-κB p65的定位和表达水平的变化；②凝胶迁移率实验（EMSA）检测核转录因子NF-κB的DNA结合活性；③AnnexinV-PE/7-AAD双染法结合流式细胞仪检测细胞凋亡；④RT-PCR检测Wnt/β-catenin与NF-κB信号通路下游靶基因survivin、c-myc和cyclinD1表达水平的变化。
结果 1.ALL细胞经GSK-3β抑制剂LiCl和SB216763处理后，GSK-3β在细胞浆中的蛋白水平未见明显变化，而其胞核蛋白表达量明显下降；β-catenin蛋白在细胞浆中的表达量显著增加，而转位入核的β-catenin表达略有增加；核转位蛋白NF-κB P65在胞浆/胞核中均无明显变化，但核内NF-κB P65的DNA结合活性明显降低。 2.SB216763浓度梯度增加（5、10、15μM）的实验组细胞凋亡率随之升高，分别为（36±5）%、（52±7）%和（70±4）%，LiCl在其细胞亚毒性浓度内（5、10mM），诱导ALL细胞的凋亡呈浓度依赖性，与对照组相比均有统计学意义。 那个 3.对照组细胞经GSK-3β抑制剂LiCl和SB216763处理后，发现对照组细胞的凋亡率为15%~20%，未受到明显影响。但Western blotting结果显示转位入核的β-catenin蛋白表达显著增加。 4.RT-PCR结果显示survivin mRNA的表达水平明显下降，c-myc和cyclin D1的表达水平未见明显变化。 结论 1.以ALL原代细胞作为实验细胞，抑制其GSK-3β活性后，并不改变核转位蛋白NF-κB P65在胞浆/胞核中的表达，却下调NF-κB P65的转录活性，并通过下调抗凋亡基因survivin的表达而促进ALL细胞的凋亡；β-catenin的表达水平增加并未明显影响细胞的凋亡与增殖，其机理有待进一步的研究。 2.对照组细胞经GSK-3β抑制剂处理后，细胞凋亡未受明显影响，推测可能与Wnt/β-catenin信号的活化有关。
实验目的：
通过高脂饮食和STZ诱导建立2型糖尿病大鼠模型，利用Langendorff离体心脏灌流模型，观察高压氧预处理对正常及糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响，并探讨其对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤保护作用及其机制，寻找保护糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的新方法。 实验方法： 第一部分实验：75只成年雄性Wistar大鼠，体重250-300g，随机分为正常组（N组30只）：给予基础饲料喂养；糖尿病实验组（D组，45只）：高脂饲料喂养4周后给予2%STZ一次性腹腔注射（40mg／kg），1周后尾尖血检测血糖，以血糖＞16.7mmol／L为糖尿病模型成功。大鼠继续常规饲料喂养2个月。 将正常大鼠（N组）及成模后糖尿病大鼠（D组）各自分为三组，每组10只，分别为正常对照组（N-C组）、正常缺血/再灌注组（N-I／R组）、正常高压氧预处理组（N-P组）、糖尿病对照组（D-C组）、糖尿病缺血/再灌注组（D-I／R组）、糖尿病高压氧预处理组（D-P组）。生物机能试验系统记录血液动力学指标，包括HR、LVSP、+dp/dtmax，留取冠脉流出液检测心肌酶。心肌组织匀浆利用试剂盒测定SOD的活性及MDA的生成量。灌流结束后行TTC染色，测定心肌梗死面积。行心肌HE染色观察心肌组织结构的变化。 Fludarabine供应商 第二部分实验：2型糖尿病动物模型建模方法同第一部分实验。增加沃尔曼青霉素（wortmannin）干预组，具体分组如下：正常对照组（N-C组）、正常缺血/再灌注组（N-I／R组）、正常高压氧预处理组（N-P组）、正常高压氧预处理加wortmanmin组（N-W组）、糖尿病对照组（D-C组）、糖尿病缺血/再灌注组（D-I／R组）、糖尿病高压氧预处理组（D-P组）、糖尿病高压氧预处理加wortmanmin组（D-W组）。制备大鼠离体心脏灌流（Langendorff）模型方法同第一部分实验。用TUNEL方法检测心肌细胞的凋亡，计算凋亡指数。免疫组化法检测心肌细胞caspase-3、Bcl-2、Bax、细胞色素C、Akt、pAkt、GSK3及P-GSK3表达情况。蛋白质免疫印迹法（western blotting）检测组织Akt（pAkt）及GSK3（PGSK3）蛋白含量。 统计分析：数据处理应用Spss13.