1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L,作用时间分别为:24h、48h、72h;康莱特注射液组设置浓度分别为:5μl/ml、10μl/ml、20μl/ml、40μl/ml、80μl/ml、100μl/ml、160μl/ml,作用时间分别为:24h、48h、72h;应用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法分别测定吉非替尼组和康莱特注射液组的不同浓度、不同作用时间的抑制率绘制生长曲线,并分别计算吉非替尼组30%抑制率所对应浓度(IC30)与康莱特注射液组50%抑制率所对应浓度(IC50)。2确定联合用药组浓度及作用时间:根据MTT结果,吉非替尼组IC30=25μl/ml,康莱特注射液组IC50=40μl/ml,故联合用药组吉非替尼取25μl/ml,康莱特注射液取40μl/ml,作用时间为48小时,应用MTT法检测定各时间联合用药组的抑制率。3取对数生长期细胞,按上述分组进行处理。药物作用48h后提取总RNA,检测总RNA的量、纯度及浓度,通过逆转录-聚合酶链反应(reverse

还有 transcription PCR,RT-PCR)半定量检测各组细胞内Akt基因和MAPK1(ERK2)基因的m RNA的表达水平。4选取对数生长期细胞置入六孔板培养,分组处理同上。药物作用48h后提取总蛋白,检测总蛋白浓度,蛋白质印迹(Western-blot)法检测各组p-Akt与p-ERK蛋白表达情况。5运用IBM SPSS 获悉更多 Statistics 22.0.0.0统计软件对数据进行处理。结果:1 MTT结果显示:1.1与对照组相比,随着康莱特注射液组浓度增加及作用时间的延长,对人肺腺癌NCI-H1975细胞的抑制率逐渐升高,其抑制作用有剂量及时间依赖效应;吉非替尼单药24h组随药物浓度的升高,在0.1-5μmol/l范围内未见其对人肺腺癌NCI-H1975细胞有明显抑制情况,在10-50μmol/l范围内出现对人肺腺癌NCI-H1975细胞生长轻度抑制,在吉非替尼单药48h、72h组对人肺腺癌NCI-H1975细胞的抑制率逐渐升高,呈时间、剂量依赖关系。1.2联合用药组:吉非替尼联合康莱特注射液培养48h后,两药联合作用抑制率高于各单药组,有统计学意义(P<0.05)。结论:1康莱特注射液和吉非替尼单独应用对人肺腺癌NCI-H1975细胞生长均有抑制作用,而两药联合抑制作用增强,具有协同增效作用。2康莱特注射液和吉非替尼单独应用均能下调Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表达水平,而两药联合对Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表达水平下调作用更显著。3康莱特注射液具有一定逆转人肺腺癌NCI-H1975细胞耐吉非替尼的作用,可能与下调耐药细胞内Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表达水平相关。
癌症是一种DNA损伤修复反应(DDR)失能的疾病。随着人们对肿瘤中的重要细胞信号通路越来越多地了解,靶向治疗成为了目前癌症治疗的一种有效手段。使用药物作用于更多特殊、失调和突变的信号通路来抑制致癌激酶的方法是癌症治疗的一个较好的选择。因此,致癌激酶的抑制剂研发对癌症治疗具有十分重要的实际意义。计算机辅助药物分子设计能够合理地增大新药发现和确定新药靶点的可能性,并且能够有效减少成本,推动抗癌药物研发的进程。在本论文的第一章中,我们强调了肿瘤的引发与增生是与控制细胞周期,DNA修复和细胞凋亡的机制紊乱等因素直接相关的,并对致癌激酶的分类和结构又进行了重点分析。而且,我们也对具有抗癌作用的激酶抑制剂的类别和现状进行了系统的综合分析。此外,我们还简短地介绍了药物发现的一般流程,突出了计算机辅助分子设计方法的重要性。Chkl,作为一种传递DNA损坏信号的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,由于参与癌症引发和扩散,成为了抗癌药物作用的重要靶点。而到目前为止Chk1的一种新型抑制剂三唑酮类化合物活性变化的结构依据仍不明确。在论文的第二章中,我们采用综合性计算研究方法(分子对接、MD模拟、结合自由能计算)探索了影响活性的关键结构因素。为了确定影响三唑酮化合物抑制剂活性的结构特点,我们选用另一种已投入临床使用的Chkl抑制剂MK-8776作为参照进行了模拟研究。从分子水平上对三唑酮抑制剂进行比较分析,从而揭示了重要的结构和能量性质。所研究的抑制剂总体上都与Chk1的残基Leu14,

什么 Val22, Ala35, Glu84, Tyr85,Cys86和Leu136构成的活性口袋结合。而且,在三唑酮抑制剂分子中引入疏水基团有利于与Chk1结合,残基Leu136在Chk1-MK-8776中对总体结合自由能的贡献与其在Chkl-三唑酮复合体系中的贡献存在较大差别恰好证实了这一点。R1位上的极性氢原子与残基Cys86形成的氢键可以使抑制剂处于一种有利于与Chkl结合的位置。但是,向R2位引入亲水基团将容易减小结合作用力。这项研究工作所获得的信息将有利于指导更加有效的靶向Chkl新型抑制剂的设计。黄酮,属于黄酮类化合物的一种,由于其潜在的医学用途吸引了人们的广泛关注。最近研究发现,一系列的黄酮化合物能够有效抑制CK2,并且副作用较小。但是,到目前为止,CK2与黄酮化合物之间的准确结合模式以及影响生物活性的结构依据还不十分清楚。在论文的第三章,我们采用计算研究方法从分子水平上详细解释了CK2与黄酮化合物的相互作用机制。首先我们从四种不同的对接方式的对接结果中获得相对可靠的起始复合物结构。接着采用MD模拟和结合自由能计算与分解进一步研究,我们发现预测的结合自由能与pIC50具有较好的相关性(R=0.