05），且促炎因子对ADAMTS-4mRNA的诱导作用具有剂量依赖性（p<0.05）。促炎因子可以提高ADAMTS-4启动子的活性（p<0.05）。使用DN-p38α，DN-pβ2，DN-p38γ及DN-ERK1共转染后，促炎因子对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用被抑制（p0.05）。使用过表达p65/RelA质粒转染髓核细胞后，ADAMTS-4启动子活性升高（p0.05）；使用过表达p65/RelA和/或p50质粒转染髓核细胞后，只有p65/RelA可以提高ADAMTS-4启动子活性，p50对ADAMTS-4启动子活性没有作用（p>0.05）。p50可以完全抑制p65对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用（p<0.05）,此外，p50还可以抑制促炎因子TNF-α及IL-1β对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用（p<0.05）。使用NFβB通路抑制剂SM7368处理髓核细胞后，促炎因子对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用被完全抑制（p0.05）。
结论：1. ADAMTS-4在成熟大鼠髓核组织及纤维环组织中均有表达，在生理状态下，ADAMTS-4在大鼠椎间盘组织中的表达水平很低。2.促炎因子TNF-和IL-1在mRNA以及蛋白水平对ADAMTS-4的表达均有正调节作用，且这种调节作用具有剂量依赖性。3.促炎因子TNF-和IL-1在转录水平对ADAMTS-4启动子活性具有诱导作用。4. selleckchem TNFα和IL-1β对ADAMTS-4表达的调节是通过激活MAPK及NF B信号通路起作用的，MAPK传导通路对ADAMTS-4表达的调节具有亚型特异性的特点； NFκB传导通路对ADAMTS-4表达调节的作用靶点主要为p65亚基，p50则能够抑制促炎因子及p65对ADAMTS-4启动子活性的诱导作用。 第二部分：ADAMTS-4在椎间盘退变中的作用及机制研究 研究背景:腰痛(Low Back Pain)是一种可由多种疾病如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、腰椎滑脱症及退变性腰椎侧弯症等导致的与椎间盘退变(Intervertebral DiscDegeneration, IVDD)密切相关的极为常见的临床疾病，目前公认椎间盘退变主要是由细胞外基质如蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的合成代谢与分解代谢的不平衡造成的，具体表现为：蛋白聚糖(以聚集蛋白聚糖Aggrecan为主)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)等基质大分子的减少及椎间盘髓核细胞数量减少和功能降低，最终导致椎间盘应力改变和椎间高度丢失从而造成椎间盘的生物力学功能丧失。尽管人们已经越来越意识到蛋白聚糖的合成及分泌在椎间盘功能中的重要性，无论在正常椎间盘还是退变椎间盘中，调节蛋白聚糖降解的分子机制还没有研究清楚。相关研究结果表明：在椎间盘退变及突出的过程中，髓核细胞分泌了大量的促炎症因子如TNF-α和IL-1β，而在髓核细胞中这两种炎症因子还可以上调两种主要的蛋白聚糖酶(ADAMTS-4和ADAMTS-5)的表达。在ADAMTS家族的众多成员中，目前普遍认为ADAMTS-4和ADAMTS-5最有可能在蛋白聚糖降解及随之而来的骨性关节炎中及椎间盘退变的过程中起到重要作用。值得注意的是，尽管ADAMTS-4和ADAMTS-5在骨关节炎及椎间盘退变性疾病中具有很重要的意义，关于ADAMTS-4和ADAMTS-5在椎间盘退变中的具体作用机理及二者在椎间盘退变中的相对贡献目前尚无明确报道。因而，进一步深入探讨并阐明ADAMTS-4和ADAMTS-5在椎间盘退变过程中的作用及具体机制，为下一步延缓乃至阻止椎间盘退变提供可能的分子生物学治疗依据具有重要的意义。
目的：研究NF-κB信号通路在椎间盘退变中的作用机理，探讨ADAMTS-4和ADAMTS-5在椎间盘退变中的作用及相对贡献，为下一步针对椎间盘退变的靶向治疗提供分子生物学依据。 Tyrosine Kinase 抑制剂 Library价格 方法：通过慢病毒载体介导的NF-B通路亚基p65、p52、IKKα及IKKβshRNA来抑制NF-κB在髓核细胞中的表达以进一步阐明NF-κB信号通路在髓核细胞中对ADAMTS-4及ADAMTS-5表达的调控作用。使用激光共聚焦显微镜检测转染了慢病毒的髓核细胞中的黄色荧光蛋白YFP来保证转染的有效性。应用Western blot方法确认p65，p52I，KKα，IKKβ在髓核细胞中的表达被成功抑制后使用Western blot的方法对ADAMTS-4, ADAMTS-5及ADAMTS4/5特异的蛋白聚糖降解产物ARGSVIL的表达进行了检测。构建sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5慢病毒载体并转染人髓核细胞。应用Western
blot方法确认ADAMTS-4及ADAMTS-5在髓核细胞中的表达被成功抑制；然后检测TNF-α刺激后蛋白聚糖降解产物ARGSVIL, NITIGE水平的变化。 结果：成功构建sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ慢病毒载体并转染人髓核细胞，使用激光共聚焦显微镜检测黄色荧光蛋白YFP，结果提示转染效率高于90%，且细胞生长未受影响。Western Blot检测转染髓核细胞中p65、p52、IKKα及IKKβ在蛋白水平的表达，结果显示：相比于对照组（LV-shC）, sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ组相应各亚基的表达水平下降。灰度分析结果显示，相对于对照组，sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ组相应各亚基的生成被抑制；使用TNF-处理慢病毒转染后的细胞，结果显示sh-p65、sh-p52、sh-IKKα、sh-IKKβ可阻断TNF-α对ADAMTS-4,ADAMTS-5及蛋白聚糖降解产物ARGSVIL表达的诱导作用。成功构建sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5慢病毒载体。应用Western 购买ABT-263 Blot检测转染后条件培养基组及细胞蛋白组中ADAMTS-4及ADAMTS-5的表达水平，结果显示，相比于对照组（LV-shC），sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5组相应蛋白的表达水平下降。通过Western Blot方法检测使用TNF-处理慢病毒转染后髓核细的胞蛋白聚糖降解产物ARGSVIL和NITIGE的表达情况，结果显示sh-ADAMTS-4及sh-ADAMTS-5可阻断TNF-α对蛋白聚糖降解产物ARGSVIL和NITIGE表达的诱导作用。 结论：1.敲除NF-B信号通路各亚基可阻断TNF-对ADAMTS-4、ADAMTS-5及蛋白聚糖降解产物ARGSVIL表达的诱导作用。2.敲除ADAMTS-4或ADAMTS-5均可减少人髓核细胞中蛋白聚糖的降解（p<0.