以缺陷性腺病毒(Ad-GFP)为载体介导HGF基因转染血管内皮祖细胞并计算转染效率 3.建立裸鼠缺血后肢模型后,将裸鼠分为3组,分别为空白对照组、EPCs组、HGF病毒转染EPCs组(Ad-HGF-EPCs),损伤后即刻及24h后分别将生理盐水、内皮祖细胞、携带HGF基因的EPCs以2×108cells细胞数由尾静脉注入裸鼠尾静脉。控制各鼠都输入同样生理盐水。观察期缺血肢体表现,ELISA检测血清HGF表达水平,激光多普勒(LDPI)检测血流灌注,CD31免疫组化检测毛细血管密度。 结果 1.成功分离和培养出大鼠骨髓血管内皮祖细胞,EPCs摄取Dil-acLDL、结合FITC-UEA-1双荧光细胞阳性率为(88.0±5.0)%。 2.成功将HGF基因转染大鼠骨髓血管内皮祖细胞,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,转染72h后,转染效率高达80%以上。

一般 3.实验中成功建立缺血后肢模型。术后2天,三组裸鼠缺血后肢功能评分迅速升至高峰,证实建模成功。HGF基因转染EPCs移植后,肢体自截率及坏死率明显降低,缺血后肢功能评分明显较EPCs组低,证实移植后有利于肢体存活和功能恢复。而且ELISA证实Ad-HGF-EPCs移植后体内HGF蛋白持续高表达,术后2天后即达峰值,此后逐渐降低,但仍高于未转染EPCs移植及空白对照,并至少持续21天。激光多普勒及CD31免疫组化检测发现HGF基因转染EPCs移植后,缺血后肢血流灌注量和血管密度显著增加,作用远强于EPCs单独移植。 结论 腺病毒介导的HGF基因转染血管内皮祖细胞移植缺血后肢裸鼠后,可在体内持续过表达HGF蛋白,促进缺血后肢的血管生成,增加血管密度和血流量,改善后肢循环,有利于肢体存活和功能恢复。
目的 蛋白酶活化受体4（protease-activated receptor，PAR4），是蛋白酶活化受体家族成员之一，属于G蛋白偶联受体。研究发现PAR4在正常和炎症条件下参与调节疼痛反应，目前PAR4在痛觉调节中的作用机制尚不清楚，可能是经过细胞内的信号转导机制作用于周围感觉神经元，其中部分可能是通过致敏瞬时受体电位香草酸亚型1（Transient 这个 receptor potential vanilloid1TRPV1）参与外周伤害性刺激的调节。为了进一步了解PAR4在背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）初级感觉神经元的表达，及与伤害性感觉受体TRPV1的共存，探究PAR4在外周伤害性感觉信号传导中的作用提供形态学依据。 方法 1.应用免疫荧光组织化学双标法结合激光共聚焦显微镜技术，观察PAR4在大鼠和小鼠DRG初级感觉神经元的表达及与TRPV1的共存。 2.腹腔内注射醋酸建立内脏疼痛大鼠动物模型，应用免疫荧光组织化学双标法结合激光共聚焦显微镜技术，观察PAR4在DRG初级感觉神经元的表达变化。结果 1. PAR4在小鼠DRG初级感觉神经元的表达及与TRPV1的共存：免疫荧光显示小鼠DRG内见有大量的感觉神经元表达PAR4，其形态多为中、小型的圆形、卵圆形，以及少量的大型神经元，可见少部分阳性神经元纤维。有80.5%±3.1%（3672/4558）神经元表达PAR4。免疫荧光双标法显示DRG内可见较多的TRPV1阳性神经元，均为中、小型感觉神经元胞体，许多DRG的PAR4阳性神经元的表达均与TRPV1的共存，有76.9%±3.4%(2826/3672)的PAR4阳性神经元表达TRPV1，有77.4%±3.1%(2826/3647)的TRPV1阳性神经元表达PAR4。

2. PAR4在大鼠DRG初级感觉神经元的表达及与TRPV1的共存：PAR4在大鼠的DRG内的表达与小鼠类似，同样见有大量的感觉神经元表达PAR4，其形态多为中小型的圆形、卵圆形，以及少量的大型神经元，细胞计数显示：有85.4%±4.1%（4337/5078）神经元表达PAR4。免疫荧光双标法显示有83.5%±3.6%(3623/4337)的PAR4阳性神经元表达TRPV1，有88.3%±3.5%(3623/4102)的TRPV1阳性神经元表达PAR4。

3.PAR4与CGRP在大鼠DRG初级感觉神经元的共存：免疫荧光显示大鼠DRG内见有大量的感觉神经元呈CGRP阳性，其形态多为中、小型的圆形、卵圆形，以及少量的大型神经元，并观察到部分CGRP阳性神经纤维，有75.6%±4.1%（3387/4478）阳性神经元表达CGRP。免疫荧光双标法显示有82.3%±4.6%（2788/3387）PAR4阳性神经元表达CGRP，有64.2%±3.7%（2788/4337）CGRP阳性细胞均表达PAR4。 Angiogenesis抑制剂 4. TRPV1与CGRP在大鼠DRG初级感觉神经元的共存：DRG内TRPV1阳性神经元与CGRP阳性细胞类似，均为中、小型感觉神经元胞体和一些弥散神经纤维。免疫荧光双标显示TRPV1/CGRP在DRG感觉神经元内广泛的共存，有83.9%±3.6%（2842/3387）CGRP阳性细胞均表达TRPV1，有69.2%±3.2%（2842/4102）TRPV1阳性细胞表达CGRP，也可观察到少量的TRPV1单标神经元或CGRP单标神经元。 5. PAR4在内脏疼痛大鼠动物模型中DRG感觉神经元的表达变化，在内脏疼痛大鼠动物模型DRG内PAR4阳性感觉神经元的数量明显增加，细胞计数显示PAR4阳性感觉神经元的数量与正常大鼠相比，增长了11.1%±2.3%，有96.5%±4.3%（5336/5528）神经元表达PAR4。同时DRG内TRPV1阳性神经元的数量也明显增加，有95.0%±4.4%（5110/5378）神经元表达TRPV1。免疫荧光双标显示有较多的PAR4/TRPV1双标细胞,分别占PAR4阳性和TRPV1阳性细胞的88.8%±3.7%(4742/5336)和92.7%±3.4%(4742/5110)。实验结果显示在大鼠DRG内见有许多感觉神经元表达PAR4，并与TRPV1广泛的共存。结论 1.PAR4在大鼠和小鼠的DRG初级感觉神经元有广泛的表达，主要为中、小型神经元。 2.PAR4与TRPV1在DRG初级感觉神经元存在广泛的共存，说明PAR4参与外周伤害性刺激可能与TRPV1的功能调节有关。 3.